東方巴貝斯蟲cDNA文庫(kù)構(gòu)建及其應(yīng)用.pdf

1、東方巴貝斯蟲是一種經(jīng)鐮形扇頭蜱傳播的重要血液原蟲，是由本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)和命名的一個(gè)巴貝斯蟲新種，主要引起水牛巴貝斯蟲病。該病在我國(guó)長(zhǎng)江以南許多省份發(fā)生和流行，臨床上患病牛以高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等為特征，甚至引起死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。 本研究首先進(jìn)行了 B.orientalis的分子分類學(xué)研究，在此基礎(chǔ)上建立了B.orientalis的半巢式PCR診斷方法，然后構(gòu)建了 B.orientalis cDNA文庫(kù)，以該文庫(kù)為基礎(chǔ)

2、，進(jìn)行了B.orientalis EST序列的測(cè)定和分析，并進(jìn)一步克隆和原核表達(dá)了東方巴貝斯蟲熱休克蛋白70(HSP70)基因。 (1)B.orientalis分子分類學(xué)研究利用真核生物18S rRNA通用引物擴(kuò)增了B.orientatis 18S rRNA基因。測(cè)序后BLAST 分析表明該蟲種屬巴貝斯蟲。將該基因1，700 bp長(zhǎng)片段序列與 GenBank中15種已知巴貝斯蟲的相應(yīng)序列進(jìn)行比較分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，B

3、.orientalis 與南非未定種的巴貝斯蟲親緣關(guān)系最近，與羊巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近，與牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這一結(jié)果從分子生物學(xué)上進(jìn)一步證實(shí)了東方巴貝斯蟲是一獨(dú)立種。 (2)B.orientalis半巢式PCR診斷方法的建立與應(yīng)用根據(jù) B.orientalis 18S rRNA基因V<,4>多變區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè) B.orientalis的半巢式PCR，特異性擴(kuò)增 B.orientalis 18S rRN

4、A基因257 bp的片段，敏感性試驗(yàn)表明其敏感性達(dá)到0.00000012％。運(yùn)用建立好的半巢式PCR 與傳統(tǒng)的姬姆薩染色顯微鏡檢的方法對(duì)湖北長(zhǎng)江以南4個(gè)巴貝斯蟲病疫區(qū)121份水牛血樣，385份鐮形扇頭蜱樣品及湖北長(zhǎng)江以北3個(gè)巴貝斯蟲病非疫區(qū)71份水牛血樣進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為：湖北長(zhǎng)江以南4個(gè)疫區(qū)，血液樣品鏡檢5份陽(yáng)性，半巢式PCR 24份陽(yáng)性，蜱的樣品半巢式 PCR 35份陽(yáng)性；湖北長(zhǎng)江以北3個(gè)非疫區(qū)鏡檢梨形蟲17份陽(yáng)性，半巢式PCR

5、 未檢測(cè)到陽(yáng)性樣品。針對(duì)上述檢測(cè)結(jié)果，利用18S rRNA通用引物擴(kuò)增非疫區(qū)的17份陽(yáng)性模板，測(cè)序后分析均為泰勒蟲。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本試驗(yàn)建立的 B.orientalis 半巢式PCR檢測(cè)方法具有很高的特異性和敏感度，是一個(gè)快速有效的檢測(cè)方法。從流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果顯示：B.orientalis 在湖北長(zhǎng)江以南廣泛分布，流行嚴(yán)重。 (3) B.orientalis cDNA文庫(kù)的構(gòu)建利用E.Z.N.A<'TM>Blood RNA K

6、it提取純化的紅細(xì)胞期B.orientalis的總RNA，利用SMART<'TM> cDNA Library Construction Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，LD-PCR擴(kuò)增長(zhǎng)片段 cDNA，連接λTriplEx2噬菌體載體，利用Gigapack Ⅲ Gold Packaging Kit體外包裝，構(gòu)建了B.orientalis cDNA文庫(kù)。對(duì)原初文庫(kù)及擴(kuò)增文庫(kù)的質(zhì)量和滴度的監(jiān)測(cè)表明：文庫(kù)的插入片段在0.5～3.0 kb之間，

7、藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)表明其重組率約98.8％，原初文庫(kù)的滴度為 2.0x10<'6> pfu/mL，擴(kuò)增文庫(kù)的滴度為5.8x10<'8>pfu/mL。結(jié)果表明：成功的構(gòu)建了B.orientalis cDNA文庫(kù)。利用制備的抗B.orientalis 兔血清對(duì)構(gòu)建好的B.orientalis cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選，篩選到3個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性克隆子。測(cè)序后BLAST分析分別為：B.orientalis熱休克蛋白70(HSP70)基因，核動(dòng)蛋白基因及功能未

8、知的假定蛋白基因。 (4) B.orientalis EST序列的測(cè)定及分析從B.orientalis cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取噬菌斑，轉(zhuǎn)染BW25.8，經(jīng)PCR鑒定后送插入片段大于300 bp的陽(yáng)性克隆子測(cè)序，共測(cè)定了324條B.orientalis EST序列，對(duì)有效EST 序列運(yùn)用phrap等軟件進(jìn)行拼接，聚類后BLAST 分析，得到46個(gè)同源性較高的unigene，這些基因分別為：類紅細(xì)胞表面抗原、類裂殖體表面抗原、代謝相

9、關(guān)的磷酸酶及蛋白酶、核糖體蛋白、熱休克蛋白70、類熱休克蛋白90、肌動(dòng)蛋白、鋅指蛋白等基因的部分或全基因及功能未知的假定蛋白基因部分或全基因。 (5) B.orientalis HSP70基因的克隆與原核表達(dá)根據(jù) EST 測(cè)序的結(jié)果，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性擴(kuò)增B.orientalis HSP70基因開放性讀碼框(ORF)的引物，克隆了B.orientalis HSP70的ORF全長(zhǎng)基因，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-KG-HSP70，在E

10、.coli BL21-CodonPlus中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blot檢測(cè)分析，結(jié)果表明原核表達(dá)的HSP70具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)原性。 本研究對(duì)B.orientalis的分子分類學(xué)研究，從分子水平證實(shí)了B.orientalis是一獨(dú)立的新種。建立的半巢式PCR診斷方法，解決了目前水牛巴貝斯蟲病不易準(zhǔn)確診斷的難題，對(duì)水牛巴貝斯蟲病的臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查等具有重要意義。本研究構(gòu)建的B.orientalis的cD