東方巴貝斯蟲(chóng)新型診斷方法的建立和基因組序列測(cè)定與分析.pdf

1、東方巴貝斯蟲(chóng)(Brabesia orientalis)是一種蜱傳性血液原蟲(chóng),由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播,僅對(duì)水牛致病。該病主要在我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)發(fā)生和流行,臨床癥狀主要為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡,對(duì)我國(guó)的水牛養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)東方巴貝斯蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)、流行病學(xué)、生活史、診斷方法以及分子分類(lèi)學(xué)等進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究,但仍缺乏快速高效、敏感特異、實(shí)時(shí)定量的檢測(cè)方法,同時(shí)關(guān)于東方巴貝斯蟲(chóng)基因組的研究也未有

2、報(bào)道。
　　 為此,本研究首先建立了東方巴貝斯蟲(chóng)反向線(xiàn)性斑點(diǎn)雜交(RLB)技術(shù),并利用該方法對(duì)中國(guó)湖北地區(qū)水牛、梅花鹿和南非比勒陀利亞的綿羊和山羊血液樣品的血液原蟲(chóng)進(jìn)行了鑒定和流行病學(xué)調(diào)查；隨后建立了東方巴貝斯蟲(chóng)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)方法,并利用這兩種方法分別對(duì)湖北地區(qū)的水牛的東方巴貝斯蟲(chóng)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查；利用東方巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性血清對(duì)東方巴貝斯蟲(chóng)cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選,

3、克隆和表達(dá)了3個(gè)免疫相關(guān)基因；對(duì)東方巴貝斯蟲(chóng)基因組進(jìn)行了序列測(cè)定和初步分析；克隆、注釋了東方巴貝斯蟲(chóng)的線(xiàn)粒體基因組,并對(duì)該基因組進(jìn)行了多態(tài)性分析。
　　 (1)東方巴貝斯蟲(chóng)反向線(xiàn)性斑點(diǎn)雜交(RLB)檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用利用巴貝斯蟲(chóng)和泰勒蟲(chóng)18S.rRNA的v4高變區(qū)兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)屬特異性引物RLB-F和RLB-R(Gubbels et al.,1999),并根據(jù)東方巴貝斯蟲(chóng)(B.orientalis)18SrRNA基因v4

4、高變區(qū)設(shè)計(jì)特異性探針,建立東方巴貝斯蟲(chóng)RLB檢測(cè)方法,運(yùn)用建立的方法對(duì)采自中國(guó)湖北省9個(gè)不同地區(qū)的304份水牛血液樣品進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明,感染湖北地區(qū)水牛的梨形蟲(chóng)有4種,分別是水牛泰勒蟲(chóng)、東方巴貝斯蟲(chóng)、牛巴貝斯蟲(chóng)和雙芽巴貝斯蟲(chóng),其陽(yáng)性率分別是19.1％(58),8.9％(27),1％(3)和0.7％(2)；用RLB檢測(cè)了采自湖北省的24份梅花鹿血樣、南非比勒陀利亞的82份綿羊和244份山羊血樣。結(jié)果表明,梅花鹿、綿羊和山羊樣品都沒(méi)有任

5、何巴貝斯蟲(chóng)的雜交信號(hào),三種樣品的泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性率分別是29.20％(7/24)、28.0％(23/82)和0.8％(2/244)。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,可能存在鹿的泰勒蟲(chóng)新種,南非樣品結(jié)果顯示犀牛泰勒蟲(chóng)(T.bicornis)和黑貂泰勒蟲(chóng)未定種(T.sp.sable)探針的特異性探針與分離泰勒蟲(chóng)(T.separata)等羊的泰勒蟲(chóng)的18S rRNA相似度極高,探針的特異性較低,存在交叉反應(yīng)。
　　 (2)B.oriental

6、is環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法的建立依據(jù)東方巴貝斯蟲(chóng)18S rRNA的v4高變區(qū),用LAMP引物設(shè)計(jì)專(zhuān)用軟件,設(shè)計(jì)4條識(shí)別目的片度6個(gè)特異性位點(diǎn)的引物,建立東方巴貝斯蟲(chóng)LAMP快速診斷方法。特異性試驗(yàn)表明,LAMP僅能擴(kuò)增東方巴貝斯蟲(chóng)的DNA模板,而與其他的梨形蟲(chóng)DNA無(wú)任何特異性擴(kuò)增。用該方法檢測(cè)77份長(zhǎng)江以南、88份長(zhǎng)江以北的水牛血液樣品和66份非洲水牛樣品。結(jié)果表明,南非水牛樣品全部陰性,77份長(zhǎng)江以南和88份長(zhǎng)江以北的樣

7、品,LAMP檢測(cè)的陽(yáng)性分別是24份和6份,半巢式PCR檢測(cè)的陽(yáng)性分別是12份和1份。檢測(cè)結(jié)果表明本研究成功建立了特異性高、敏感性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便的東方巴貝斯蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法,流行病學(xué)調(diào)查和統(tǒng)計(jì)分析顯示,本試驗(yàn)建立的LAMP方法比此前報(bào)道的半巢式PCR更敏感,且東方巴貝斯蟲(chóng)已經(jīng)從長(zhǎng)江以南流行到長(zhǎng)江以北。
　　 (3)B.orientalis實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法的建立利用東方巴貝斯蟲(chóng)18S rRNA的v4高變區(qū)設(shè)計(jì)TaqMan實(shí)時(shí)定量PC

8、R的引物和探針,建立東方巴貝斯蟲(chóng)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法(TaqMan real-time PCR)。該方法的檢測(cè)極限是每微升2個(gè)蟲(chóng)體,特異性試驗(yàn)表明僅東方巴貝斯蟲(chóng)DNA有特異性的擴(kuò)增曲線(xiàn)。用實(shí)時(shí)定量PCR和RLB分別檢測(cè)180份湖北地區(qū)的水牛血液樣品。結(jié)果表明,兩種方法分別檢測(cè)的陽(yáng)性樣品分別為28份和21份,其中長(zhǎng)江以北分別檢出16份和12份陽(yáng)性；陽(yáng)性樣品的染蟲(chóng)率范圍是2.0×105～2.0×100,其中有16份的染蟲(chóng)率為2.0×10

9、0～2.0×102。試驗(yàn)結(jié)果表明所建立的實(shí)時(shí)定量PCR方法能有效、定量檢測(cè)東方巴貝斯蟲(chóng)。
　　 (4)B.orientalis免疫相關(guān)基因的克隆表達(dá)利用東方巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性血清篩選東方巴貝斯蟲(chóng)cDNA文庫(kù),共得到18個(gè)陽(yáng)性克隆子,經(jīng)EST序列分析,挑選其中的3個(gè)可能與免疫相關(guān)的基因:B04——核動(dòng)蛋白基因、B05——假定蛋白基因和B41——熱休克蛋白70基因(HSP70),克隆各自的ORF,分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-B04

10、,pET-28a-B05和pET-32a-B41,在RosettaTM中高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后western blot分析,結(jié)果表明三個(gè)基因都有良好的抗原性,且證明了HSP70在東方巴貝斯蟲(chóng)中的存在。HSP70基因的核苷酸序列進(jìn)化分析表明東方巴貝斯蟲(chóng)是一歸屬于巴貝斯蟲(chóng)的獨(dú)立新種。
　　 (5)B.orientalis基因組測(cè)序本試驗(yàn)對(duì)東方巴貝斯蟲(chóng)基因組采用的Pair-end雙末端測(cè)序進(jìn)行了Solexa測(cè)序。共獲得23,898

11、,916個(gè)讀長(zhǎng),測(cè)序數(shù)據(jù)量為2,389,891,600,測(cè)序深度約為306.5倍。剔除污染和低質(zhì)量的讀長(zhǎng),組裝拼接后共獲得1284個(gè)Scaffold,總長(zhǎng)度為7,796,224bp,GC含量42.4％,與已發(fā)表的牛巴貝斯蟲(chóng)T2B株基因組GC含量41.8％相一致。結(jié)合本試驗(yàn)分析的結(jié)果和已報(bào)道的牛巴貝斯蟲(chóng)和小泰勒蟲(chóng)基因組信息,分析東方巴貝斯蟲(chóng)有4條染色體,基因組大小約為7.9 Mb。由于真核生物基因組非常復(fù)雜,而且目前所能參考的梨形蟲(chóng)基因組

12、信息相對(duì)有限,對(duì)東方貝斯蟲(chóng)基因組的具體注釋還有待進(jìn)一步研究。
　　 (6)B.orientalis線(xiàn)粒體基因組(mitochondrion DNA,mtDNA)克隆和多態(tài)性分析根據(jù)基因組測(cè)序的高通量序列和cDNA文庫(kù)釣取的部分mtDNA序列,結(jié)合NCBI公布的頂器門(mén)血液原蟲(chóng)mtDNA序列,選擇其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,克隆東方巴貝斯蟲(chóng)mtDNA并做多態(tài)性分析。測(cè)序結(jié)果用Staden package軟件進(jìn)行拼接,Artemis_v11對(duì)東

13、方巴貝斯蟲(chóng)的mtDNA進(jìn)行注釋。結(jié)果表明,東方巴貝斯蟲(chóng)mtDNA與已報(bào)道的巴貝斯蟲(chóng)和泰勒蟲(chóng)mtDNA相似,也含有3個(gè)編碼區(qū),即細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ),細(xì)胞色素氧化酶Ⅲ(COXⅢ)和細(xì)胞色素b(cytochrome b,Cytb),其大小分別為1428bp,687 bp和1092 bp,其中COXⅠ位于正義鏈,COXⅢ和Cytb均位于反義鏈上。mtDNA的COXⅠ、Cytb以及COXⅠ和Cytb結(jié)合序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明三種序列

14、得到的結(jié)果與18S rRNA基因和熱休克蛋白70(HSP70)基因進(jìn)化分析的結(jié)果一致,即東方巴貝斯蟲(chóng)歸屬于巴貝斯蟲(chóng)分支。東方巴貝斯蟲(chóng)mtDNA的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)其有99個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。
　　 本研究建立的東方巴貝斯蟲(chóng)反向線(xiàn)性斑點(diǎn)雜交(RLB)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)方法為進(jìn)行東方巴貝斯蟲(chóng)病的分子流行病學(xué)調(diào)查以及反芻動(dòng)物血液原蟲(chóng)新蟲(chóng)種的發(fā)現(xiàn)及潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供了條件；東方巴貝斯