田鼠巴貝斯蟲兩個(gè)硫氧還蛋白基因的克隆及鑒定.pdf

1、巴貝斯蟲病是由巴貝斯蟲寄生在宿主紅細(xì)胞中引起的一種血液寄生蟲病，主要通過(guò)硬蜱傳播。田鼠巴貝斯蟲（Babesia microti）感染動(dòng)物和人，主要癥狀為發(fā)熱、頭痛、疲勞、貧血等，對(duì)免疫缺陷和免疫力低下的人群具有致死性，嚴(yán)重危害人類健康，是一種新發(fā)蜱傳疾病。硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是一種廣泛存在于原核生物和真核生物中的小分子蛋白質(zhì)，它和硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)、NADPH

2、共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)，是硫氧還蛋白系統(tǒng)的重要組成部分。對(duì)瘧原蟲等血液原蟲的研究發(fā)現(xiàn)，它們生存依賴氧化還原系統(tǒng)清除體內(nèi)的氧化物，硫氧還蛋白系統(tǒng)發(fā)揮著氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御的核心功能。目前，巴貝斯蟲硫氧還蛋白系統(tǒng)還缺少研究。本研究旨在鑒定田鼠巴貝斯蟲Trx分子，為了解巴貝斯蟲的硫氧還蛋白系統(tǒng)分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。
　　本研究結(jié)果包括以下4個(gè)方面:
　　一、通過(guò)田鼠巴貝斯蟲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用生物信息學(xué)軟件比對(duì)分析，篩

3、選出田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白(Trx)基因序列。通過(guò)3'和5'RACE技術(shù)克隆全長(zhǎng)田鼠巴貝斯蟲Trx-2和Trx-3基因。氨基酸序列分析顯示，田鼠巴貝斯蟲Trx-2和Trx-3基因都具有典型的硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域和WCGPC活性位點(diǎn)。
　　二、構(gòu)建了以pET-30a為載體的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，在1mM IPTG誘導(dǎo)下，成功進(jìn)行了重組蛋白的表達(dá)，經(jīng)親和層析純化，獲得重組蛋白。
　　三、胰島素還原實(shí)驗(yàn)顯示，重組Tr

4、x-2和Trx-3蛋白都有還原活性。Trx-2還原活性隨反應(yīng)時(shí)間增加不斷增大，4分鐘后達(dá)到平穩(wěn)峰值;Trx-3還原活性迅速，即刻達(dá)到平穩(wěn)峰值，與陽(yáng)性對(duì)照組相似。
　　四、通過(guò)Western blot鑒定，證明蟲體Trx-2和Trx-3天然蛋白的分子量大小分別為15.5kDa和21.7kDa，且蟲體在紅細(xì)胞中分裂高峰期時(shí)Trx-2和Trx-3大量表達(dá)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFAT)證明Trx-2和Trx-3天然蛋白主要存在于細(xì)胞漿中。