24nt-siRNA在水稻強弱粒藻漿充實中的功能及作用機(jī)制研究.pdf

1、24nt-siRNAs是水稻籽粒中數(shù)量最多的小干擾RNA，在水稻的強弱勢粒灌漿期間呈規(guī)律性分布:隨著灌漿的持續(xù)，強勢粒和弱勢粒中24nt-siRNA的表達(dá)量逐漸降低，但各個時期弱勢粒中24nt-siRNA表達(dá)量都高于強勢粒。因此研究籽粒中24nt-siRNA表達(dá)量變化對水稻強弱勢籽粒灌漿充實的影響具有重要意義。
　　采用亞硫酸鹽測序法檢測了新豐2號第12條染色體上一個DNA區(qū)段胞嘧啶甲基化狀態(tài)，5'RACE擴(kuò)增法檢測了24nt-s

2、iRNA對靶基因的切割。根據(jù)簡易RNAi構(gòu)建法分別構(gòu)建了三個水稻胚乳特異性干擾載體DCL3ai、polIVi和RDR2i，得到三類RNAi轉(zhuǎn)基因株系T0代，并對陽性轉(zhuǎn)基因株系目的基因表達(dá)量和籽粒表型進(jìn)行了檢測。主要結(jié)果如下:
　　1.亞硫酸鹽測序法結(jié)果表明，強弱勢粒間DNA甲基化水平存在一定差異。強勢粒中CG，CHG和CHH三類胞嘧啶甲基化水平都高于弱勢粒，其中CHG和CHH類占靶基因總胞嘧啶的72.5％，兩者甲基化水差異顯著(P

3、＜0.05)，而強弱勢粒間CG類甲基化水平高達(dá)98％，但不存在差異。24nt-siRNA的RT-PCR驗證結(jié)果表明，弱勢粒24nt-siRNA表達(dá)量高于強勢粒。強弱勢粒間CHG和CHH類甲基化差異是導(dǎo)致DNA甲基化差異的主要原因，而弱勢粒24nt-siRNA表達(dá)量高可能是由于甲基化水平低造成的。
　　2.從新豐2號強弱勢粒籽粒小RNA靶基因的預(yù)測結(jié)果中，挑選9個靶基因進(jìn)行5'RACE的切割驗證。通過靶基因擴(kuò)增和TA克隆，得到了3個

4、靶基因的TA克隆，測序結(jié)果分析表明只有基因LOC_Os06g19990測序正確。根據(jù)LOC-Os06g19990靶基因的序列和siRNA的測序結(jié)果，搜集了分布在LOC_Os06g19990的5'RACE接頭附近的siRNA共13個。對這13個siRNA的堿基序列，堿基長度，TPM和靶基因切割位點對應(yīng)siRNA的5'端堿基位置進(jìn)行統(tǒng)計和分析，表明24nt長度的siR478391與靶基因序列完全互補，TPM相對較高，切割點對應(yīng)siR4783

5、91中間區(qū)段5，端第9和10個堿基之間，切割靶基因LOC-Os06g19990的可能性最大。
　　3.采用簡易RNAi構(gòu)建法成功構(gòu)建了3個水稻籽粒胚乳特異性啟動子Gt13a啟動的簡易RNAi干擾載體:DCL3ai、polIVi和RDR2i，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到三類RNAi轉(zhuǎn)基因水稻的T0代。對RNAi轉(zhuǎn)基因水稻葉片進(jìn)行GUS染色，發(fā)現(xiàn)共有10株RNAi轉(zhuǎn)基因葉片切口處呈現(xiàn)出藍(lán)色。RT-PCR實驗結(jié)果表明，這10株轉(zhuǎn)基因水稻籽粒中目