急性髓系白血病TFPI-2基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化的研究.pdf

1、背景：近年來研究表明，DNA甲基化尤其是抑癌基因的高甲基化所致失表達(dá)在白血病的發(fā)生、發(fā)展、診斷及其預(yù)后方面有重要作用。組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因是一種帶有Kunitz型結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員，可通過影響細(xì)胞外基質(zhì)的重塑參與組織發(fā)生、傷口愈合、血管生成、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等生理病理過程。TFPI-2作為一種抑癌基因，在非小細(xì)胞肺

2、癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌等人類多種腫瘤中由于啟動(dòng)子甲基化而沉默，從而使其抑制細(xì)胞生長及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用喪失。目前有關(guān)急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者TFPI-2甲基化的相關(guān)研究國內(nèi)外報(bào)道較少，TFPI-2甲基化與AML發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系尚不明確。本研究檢測AML患者在初診、緩解及復(fù)發(fā)/難治階段TFPI-2基因的表達(dá)情況，TFPI-2啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)，結(jié)合患者臨床特征，以探討TFPI-

3、2基因在AML中的臨床意義。
　　第一部分TFPI-2基因在急性髓系白血病的表達(dá)改變
　　目的：檢測TFPI-2基因在AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平，以初步了解TFPI-2基因在AML中的作用，探討其與AML發(fā)生、發(fā)展及危險(xiǎn)度分層及預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：
　　1.分離33例初治、19例完全緩解、12例復(fù)發(fā)/難治AML患者及15例單純?nèi)辫F性貧血患者（對(duì)照組）骨髓單個(gè)核細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測TFPI-2

4、mRNA在其中的表達(dá)水平，分析TFPI-2表達(dá)與AML患者臨床特征的關(guān)系。
　　2.將初治AML患者按化療效果分為完全緩解組(CR)和未完全緩解組（包括PR和NR），用Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較兩組間TFPI-2mRNA的表達(dá)水平。
　　3.應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，實(shí)時(shí)定量資料屬于非正態(tài)計(jì)量資料，數(shù)據(jù)用中位數(shù)和范圍表示，多組間TFPI-2mRNA表達(dá)水平的比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)

5、，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.AML各組與對(duì)照組中TFPI-2mRNA的表達(dá)初治組、完全緩解組及復(fù)發(fā)/難治組AML患者TFPI-2mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P均＜0.05）;復(fù)發(fā)/難治組TFPI-2mRNA表達(dá)水平明顯低于初治組(P=0.006);與完全緩解組相比，初治組TFPI-2mRNA表達(dá)水平也顯著降低(P=0.030)。
　　2.TFP

6、I-2的表達(dá)水平與臨床療效的關(guān)系初治組經(jīng)2個(gè)療程化療后，完全緩解組(CR)骨髓單個(gè)核細(xì)胞TFPI-2mRNA表達(dá)量顯著高于未完全緩解組(PR+NR)(P=0.031)。23例獲完全緩解AML患者緩解后骨髓中TFPI-2mRNA中位表達(dá)水平顯著高于化療前(P=0.044);10例未獲完全緩解AML患者2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化療后骨髓中TFPI-2mRNA中位表達(dá)水平與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.TFPI-2mRNA表達(dá)水

7、平與AML病程的關(guān)系本研究對(duì)4例初治AML患者進(jìn)行隨訪，其中例1、例2患者化療前TFPI-2水平低表達(dá)，化療后患者達(dá)CR后TFPI-2水平轉(zhuǎn)為高表達(dá)，并處于持續(xù)CR狀態(tài)。例3患者TFPI-2表達(dá)維持在較低水平，最終因治療無效而死亡。例4患者化療后達(dá)CR，TFPI-2表達(dá)持續(xù)高水平，于治療第5個(gè)月TFPI-2mRNA的表達(dá)水平明顯降低，該患者于1個(gè)月后出現(xiàn)白血病復(fù)發(fā)。
　　4.TFPI-2基因mRNA表達(dá)水平與AML患者臨床特征間的

8、關(guān)系TFPI-2基因的mRNA表達(dá)水平與AML患者年齡、性別、初診時(shí)白細(xì)胞數(shù)、FAB分型及染色體核型均無相關(guān)性(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.初治組、復(fù)發(fā)/難治組及完全緩解組AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中TFPI-2表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P均＜0.05），提示TFPI-2表達(dá)水平降低與AML的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)。
　　2.AML患者經(jīng)治療后獲完全緩解者，其TFPI-2表達(dá)水平較未完全緩解者明顯升高，提示TFPI-2

9、高表達(dá)者，完全緩解率高，TFPI-2與AML的治療預(yù)后相關(guān);AML患者完全緩解后，其TFPI-2表達(dá)水平較治療前明顯升高，進(jìn)一步說明TFPI-2的表達(dá)水平與AML患者的病情進(jìn)展有關(guān)。
　　3.治療前TFPI-2低表達(dá)的AML患者經(jīng)化療獲CR后TFPI-2的表達(dá)水平可升高;未能獲得CR者，TFPI-2的表達(dá)維持在較低水平;獲得CR的AML患者在復(fù)發(fā)前，出現(xiàn)TFPI-2表達(dá)水平的升高后再次降低，因此，通過檢測AML患者TFPI-2的表

10、達(dá)水平，對(duì)發(fā)現(xiàn)AML的早期復(fù)發(fā)及判斷預(yù)后有一定意義。
　　4.TFPI-2基因表達(dá)水平與患者年齡、性別、初診時(shí)白細(xì)胞數(shù)、FAB分型及染色體核型均無顯著相關(guān)性。提示TFPI-2的表達(dá)可能是一項(xiàng)獨(dú)立于這些臨床特征的預(yù)后相關(guān)因素。
　　第二部分急性白血病TFPI-2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的檢測及分析
　　目的：檢測AML患者TFPI-2基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)。分析其與TFPI-2表達(dá)下調(diào)的關(guān)系，以進(jìn)一步探討其與AML發(fā)生

11、、預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：
　　1.分離33例初治、19例完全緩解、12例復(fù)發(fā)/難治AML患者（對(duì)照組）骨髓單個(gè)核細(xì)胞，采用甲基化特異性PCR檢測啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)，15例單純?nèi)辫F性貧血患者作為對(duì)照組。
　　2.應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)數(shù)資料之間的差異比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.64例AML患者TFPI-2基因啟動(dòng)

12、子甲基化頻率為64.63％(42/64)，其中初治組、完全緩解組和復(fù)發(fā)/難治組患者中TFPI-2基因啟動(dòng)子甲基化頻率分別為66.67％(22/33)、52.63％(10/19)和83.33％(10/12)，各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中未檢測到TFPI-2基因啟動(dòng)子的甲基化。
　　2.甲基化AML患者與非甲基化AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中TFPI-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是0.165(0.005-2

13、.099)和0.597(0.011-2.787)，兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.TFPI-2基因甲基化與AML患者臨床特征間的關(guān)系TFPI-2基因的甲基化狀態(tài)與AML患者年齡、性別、初診時(shí)白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、血小板、FAB分型、染色體核型及診斷分期均無相關(guān)性(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.AML患者TFPI-2基因啟動(dòng)子甲基化頻率為64.63％(42/64)，且難治組AML患者TFPI-2甲

14、基化頻率明顯高于初治組和完全緩解組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中未檢測到TFPI-2基因啟動(dòng)子的甲基化。提示TFPI-2基因啟動(dòng)子的異常甲基化可能與AML的發(fā)病密切相關(guān)，其甲基化程度升高和表達(dá)降低均預(yù)示著預(yù)后不良，該指標(biāo)的監(jiān)測對(duì)AML預(yù)后判斷及化療方案的選擇有一定意義。
　　2.甲基化陽性患者中TFPI-2基因表達(dá)水平明顯低于非甲基化患者(P＜0.05)，提示其啟動(dòng)子CpG島的異常甲基化可能是導(dǎo)致TFP