RUNX3啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與急性白血病的相關(guān)性研究.pdf

1、本研究主要是檢測(cè)Runx3基因在急性白血病患者、細(xì)胞系及正常對(duì)照中的甲基化情況以及甲基化與基因表達(dá)之間的關(guān)系，探討Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化在白血病發(fā)病機(jī)制中的作用及其與預(yù)后的關(guān)系。 研究目的：1、探討Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化與急性白血病的相關(guān)性2、在基因水平上驗(yàn)證Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化與該基因沉默的關(guān)系3、揭示急性白血病患者Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與預(yù)后的關(guān)系 材料與方法：

2、 1、材料：RPMI-1640培養(yǎng)液、10％的小牛血清、淋巴細(xì)胞分離液、DMSO、PBS緩沖液、TRIzol，氯仿、異丙醇、75％乙醇、DEPC、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、DNA提取試劑盒、甲基化修飾試劑盒、CpG甲基化酶M．Sss I、TaqDNA聚合酶、GC Buffer、DNA mark、瓊脂糖、溴化乙錠白血病患者骨髓標(biāo)本、健康人外周血標(biāo)本、LJ937、K562、CHRF、Lovo細(xì)胞株 2、方法： 2.1細(xì)胞培養(yǎng)

3、與標(biāo)本采集使用RPMI1640吝養(yǎng)液(含10％的小牛血清)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度達(dá)1.0×106／mL時(shí)收獲細(xì)胞。經(jīng)患者及健康供者同意，取患者骨髓約2ml，健康供者外周血5ml，常規(guī)抗凝，提取單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。 2.2單個(gè)核細(xì)胞提取取抗凝骨髓或外周血，用相同體積的生理鹽水稀釋后緩慢加入至淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077)中，離心2000rpm×15分鐘，吸取白色云霧層狹窄帶，生理鹽

4、水洗滌2次。 2.3 DNA的提取與檢測(cè)按美國(guó)Omega公司的E．Z．N．A Blood DNA Kit提取試劑盒的步驟進(jìn)行細(xì)胞DNA提取，獲取的DNA樣品在核酸蛋白分析儀上行濃度及純度的檢測(cè)。使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的完整性，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2.4 RNA的提取與檢測(cè)采用Trizol-步法提取細(xì)胞總RNA，獲取的RNA樣品在核酸蛋白分析儀上行濃度及純度的檢測(cè)。使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品的

5、完整性，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2.5甲基化陽(yáng)性對(duì)照取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因組DNA1μg加入160μM的S-腺苷甲硫氨酸與CpG甲基化酶M．Sss I，37℃孵育4小時(shí)，-20℃冰箱保存。 2.6亞硫酸氫鈉修飾取基因組DNA1.5μg采用Epitect Bisulfite Kit(Qiagen，美國(guó))甲基化修飾試劑盒進(jìn)行修飾，脫硫純化后溶于20μl Elution Buffer中，-20℃冰箱保存。 2

6、.7引物設(shè)計(jì)Runx3的P2啟動(dòng)子區(qū)域富含CG二核苷酸，一旦發(fā)生甲基化將會(huì)影響基因轉(zhuǎn)錄，因此我們選取此區(qū)域檢測(cè)胞嘧啶是否發(fā)生甲基化。經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鈉修飾后的基因組DNA堿基中發(fā)生了甲基化的胞嘧啶保持不變，沒(méi)有發(fā)生甲基化的胞嘧啶將變成尿嘧啶，根據(jù)這種差異分別設(shè)計(jì)兩對(duì)不同的引物：甲基化引物正義鏈：5’-ATAATAGCGGTCGTTAGGGCGTCG-3’，反義鏈：5’-GCTTCTACTTTCCCGCTTCTCGCG-3’，未甲基化引物正義

7、鏈：5’-ATAATAGTGGTTGTTAGGGTGTTG-3’，反義鏈：5’-ACTTCTACTTTCCCACTTCTCACA-3’。 根據(jù)P2啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增RUNX3基因片段，正義鏈：5’-AGGCATTGCGC AGCTCAGCGGAGT-3’，反義鏈：5’-TCTGCTCCGTGCTGCCCTCGCACT-3’，以GAPDH為內(nèi)參照，引物正義鏈：5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反義鏈：5’-G

8、GAAGATGGTGATGGGATT-3’。 2.8甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)應(yīng)用甲基化與未甲基化引物分別進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴乙錠的2％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外檢測(cè)儀下觀察。 2.9 RT-PCR檢測(cè)Runx3基因mRNA2μgRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以cDNA為模板合成雙鏈DNA，然后進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴乙錠的2％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外檢測(cè)儀下觀察。 2.10標(biāo)本臨床資料的處理

9、新收集的骨髓片或者血片經(jīng)瑞氏染色后鏡檢，經(jīng)確認(rèn)為符合急性白血病的標(biāo)本后行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)；所有標(biāo)本的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷由各醫(yī)院的血液實(shí)驗(yàn)室完成；病人的其余臨床資料通過(guò)病案室查取。 2.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用(X)±SD表示，組間采用t檢驗(yàn)，組間率的比較采用Fisher精確概率檢驗(yàn)，采用Logistic回歸分析組間關(guān)系，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、各種細(xì)胞株的培養(yǎng)結(jié)果倒

10、置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；行細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果約為2～6×106個(gè)／mL。 2、DNA的檢測(cè)所提取DNA標(biāo)本經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)符合要求(純度：OD260／OD280為1.7～1.9)，取基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果無(wú)散在片段，表明無(wú)降解。 3、RNA的檢測(cè)所提取總RNA標(biāo)本經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)符合要求(純度：OD260／OD280為1.8～2.0)，取總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果有兩條帶分別為

11、28S與18S，表明RNA無(wú)降解。 4、病例的臨床資料通過(guò)查詢可能與急性白血病治療效果相關(guān)或者預(yù)后相關(guān)的信息，包括年齡、性別、診斷分型、初診時(shí)患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)、LDH、骨髓中原始細(xì)胞比例、兩療程誘導(dǎo)化療是否達(dá)到完全緩解等。 5、Rulax3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)健康供者及細(xì)胞系中均未檢測(cè)到Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化，50例患者中甲基化陽(yáng)性率為35.3％(18／50)

12、，F(xiàn)isher精確概率檢驗(yàn)：p=0.026<0.05，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即病人與正常人之間Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化陽(yáng)性率不同，AML33.33％(10／30)，其中M1 1例，M2 5例，M3 1例，M4 0例，M5 2例，ALL 40％(8／20)，p=0.2489>0.05，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化在AML患者與ALL患者沒(méi)有明顯差異。 6、Runx3基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果健

13、康供者及白血病細(xì)胞系中均能檢測(cè)到RLJNX3基因表達(dá)，50例白血病患者中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化的患者均未檢測(cè)到該基因的表達(dá)，沒(méi)有發(fā)生甲基化的均能檢測(cè)到該基因的表達(dá)。 7、Runx3基因甲基化患者的臨床特點(diǎn)Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化的患者初診時(shí)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓中原始細(xì)胞比例明顯高于未甲基化患者(p<0.05)，血紅蛋白濃度及血小板計(jì)數(shù)兩組沒(méi)有明顯差異(p>0.05)，將年齡、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度

14、、血小板計(jì)數(shù)，骨髓中原始細(xì)胞比例、乳酸脫氫酶、Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況等與接受兩個(gè)療程的標(biāo)準(zhǔn)化療方案后CR率做Logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CR率與骨髓中原始細(xì)胞比例、Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域是否發(fā)生甲基化有關(guān)，即骨髓中原始細(xì)胞比例高、Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化的患者CR率低，反之較高。 結(jié)論： 1、部分急性白血病患者存在Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島異常甲基化，正常對(duì)照中未檢測(cè)到Runx3基因的

15、甲基化。 2、Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化在急性淋巴細(xì)胞白血病與急性非淋巴細(xì)胞白血病均可發(fā)生，兩者之間發(fā)生甲基化的概率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3、在基因水平上驗(yàn)證Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島發(fā)生甲基化可導(dǎo)致基因沉默。 4、急性白血病患者CR率與Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域是否發(fā)生甲基化有關(guān)，發(fā)生甲基化的患者CR率低，反之較高。 5、推測(cè)Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化與白血病的發(fā)生及預(yù)后有一定的相