短暫氧化應(yīng)激對(duì)大鼠內(nèi)耳的損害及保護(hù).pdf

1、本文為進(jìn)一步探討葡萄籽提取物(低聚原花青素)在內(nèi)耳抗氧化損傷中的作用機(jī)理，選取了耳蝸血管紋作為研究靶點(diǎn)，采用半定量的逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)觀察短暫的氧化應(yīng)激和抗氧化劑的保護(hù)對(duì)血管紋特異性Isk表達(dá)的影響，觀察血管紋在耳蝸氧化和抗氧化中所到的作用。為氧化損傷及抗氧化劑在內(nèi)耳的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： 一、耳蝸血管紋和Cort i器的取材及離體培養(yǎng)。取新生7天的wistar大鼠，消毒后用頸脫法處死

2、，后斷頭；矢狀位平均分成兩半，去除腦組織，暴露耳蝸底部骨質(zhì)，在解剖顯微鏡下將聽(tīng)泡完整取出，置于所配制的生理溶液中，去除骨壁暴露螺旋韌帶，將襯于螺旋韌帶內(nèi)側(cè)壁的血管紋與螺旋韌帶剝離，取出完整的血管紋，血管紋特有的毛細(xì)血管分布可與耳蝸內(nèi)的其他相似結(jié)構(gòu)相區(qū)別，然后將去除螺旋韌帶的耳蝸中的Corti器沿蝸軸逆時(shí)針完整取下，從動(dòng)物處死到Corti器和血管紋完整取出，共需5分鐘，因而不影響所取Corti器和血管紋的生物活性，放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)在

3、37℃，5％CO<,2>孵育箱中。 二、COrt i器和血管紋細(xì)胞輪廓的觀察。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血管紋和Corti器固定，用TRITC-Philloidin避光染色，放在正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。。 三、血管紋細(xì)胞核的觀察將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血管紋用PI避光染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察是否組織中有細(xì)胞核出現(xiàn)，并觀察細(xì)胞核形態(tài)的改變。如果可見(jiàn)PI染色的細(xì)胞核，再用TIJNEL試劑盒鑒定受損細(xì)胞是否為凋亡細(xì)胞。操作步驟按照該

4、試劑盒所述步驟進(jìn)行。 四、血管紋內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)測(cè)量在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)0、10、30、60分鐘時(shí)將DHP123放入培養(yǎng)液中(終濃度為20uM)在激光共聚焦顯微鏡下，(激發(fā)波長(zhǎng)568nm，發(fā)射波長(zhǎng)615nm，)ROS產(chǎn)生且濃度發(fā)生變化時(shí)，熒光強(qiáng)度也發(fā)生變化，用Adobe Photoshop 7.0 Software做定量分析繪制ROS產(chǎn)量的時(shí)間分布圖。 五、Gorti器和血管紋細(xì)胞線粒體膜電位的測(cè)量在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)

5、30分鐘、2小時(shí)、8小時(shí)后在培養(yǎng)液中加入JC-1染色10分鐘后，PBS洗3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。 六、ABR反應(yīng)閾的測(cè)定用藥前及用藥后6個(gè)月各測(cè)一次。在隔音的電屏蔽室內(nèi)常規(guī)方法測(cè)試ABR，記錄反應(yīng)閾。用Danac-7型聲刺激器行短聲刺激，頻率20次/s，掃描時(shí)間10ms，濾波100-300Hz，聲輸出范圍0-100dB，信號(hào)疊加128次，以Ⅲ波反應(yīng)閾為標(biāo)準(zhǔn)判定聽(tīng)閾。 七、血清及耳蝸SOD檢測(cè)用藥6個(gè)月后，取每

6、只動(dòng)物血1ml和左耳蝸，測(cè)量血清和耳蝸內(nèi)的SOD。 八、RT-PCR檢測(cè)血管紋邊緣細(xì)胞Isk mRNA表達(dá)的變化提取血管紋的總RNA：每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組取分別取10個(gè)血管紋，按Trizol試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA；測(cè)定總RNA濃度、純度和完整性；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)。 研究結(jié)果： 一、短暫氧化應(yīng)激后離體大鼠血管紋和Cotti器細(xì)胞的損傷。 1、短暫氧化應(yīng)激后血管紋細(xì)胞的損傷：用

7、TRITC-Philloidin染色觀察實(shí)驗(yàn)組血管紋細(xì)胞在培養(yǎng)后的2小時(shí)和8小時(shí)后分別出現(xiàn)細(xì)胞的濃縮和溶解：用PI處理對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的血管紋，對(duì)照組在正常培養(yǎng)8小時(shí)后PI染色陰性，說(shuō)明無(wú)細(xì)胞核損傷，4％多聚甲醛固定后，PI染色見(jiàn)細(xì)胞核分布規(guī)整，無(wú)核形態(tài)改變；對(duì)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)后2小時(shí)、8小時(shí)的血管紋用PI染色，觀察到與PI結(jié)合的細(xì)胞核，且有細(xì)胞核形態(tài)的改變；為進(jìn)一步確定細(xì)胞損傷或死亡形式，用TUNEL試劑盒處理對(duì)照組正常培養(yǎng)8小時(shí)的血管紋和實(shí)

8、驗(yàn)組培養(yǎng)8小時(shí)后的血管紋，觀察到部分細(xì)胞的凋亡。 2、短暫氧化應(yīng)激后Corti器毛細(xì)胞的損傷：用TRITC-Philloidin處理對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的Corti器，正常培養(yǎng)8小時(shí)后對(duì)照組Corti器的毛細(xì)胞排列整齊無(wú)缺失；實(shí)驗(yàn)組在繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)后Corti器毛細(xì)胞出現(xiàn)缺失。 二、短暫氧化應(yīng)激后離體大鼠血管紋和Corti器細(xì)胞線粒體膜電位的改變。 1、短暫氧化應(yīng)激后耳蝸血管紋線粒體膜電位的改變：用JC-1染液處理對(duì)照

9、組和實(shí)驗(yàn)組的血管紋，觀察血管紋內(nèi)線粒體膜電位的改變，JC-1染液，在線粒體內(nèi)呈電位依賴式聚集，所以用來(lái)探測(cè)線粒體膜電位的改變，JC-1聚集在線粒體膜電位較高處，呈紅色或橘紅色。顏色消失即線粒體膜電位消失。對(duì)照組在培養(yǎng)8小時(shí)后仍無(wú)線粒體膜電位的消失；實(shí)驗(yàn)組血管紋細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位在去除氧化應(yīng)激后的30分鐘、2小時(shí)、8小時(shí)后逐漸消失。 2、短暫氧化應(yīng)激后Corti器細(xì)胞線粒體膜電位的改變：用JC-1處理對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的Corti器

10、，對(duì)照組的線粒體膜電位在正常培養(yǎng)8小時(shí)后的Corti器中存在，且主要集中分布在蓋膜區(qū)和毛細(xì)胞區(qū)；實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞線粒體膜電位在培養(yǎng)2小時(shí)后的Corti器中完全消失。 三、短暫氧化應(yīng)激后血管紋內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)測(cè)量。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)0、10、30、60、120分鐘時(shí)將DHR123放入培養(yǎng)液中(終濃度為20uM)在激光共聚焦顯微鏡下，(激發(fā)波長(zhǎng)568nm，發(fā)射波長(zhǎng)615nm，)觀察熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化：對(duì)照組血管紋中幾無(wú)ROS；短暫的氧

11、化應(yīng)激后的實(shí)驗(yàn)組中血管紋內(nèi)開(kāi)始產(chǎn)生ROS： 0時(shí)刻無(wú)ROS產(chǎn)生，10分鐘時(shí)熒光微弱；30分鐘后熒光略有增強(qiáng)；60分鐘時(shí)熒光明顯增強(qiáng)接近所觀察到的最高強(qiáng)度；120分鐘時(shí)與60分鐘時(shí)強(qiáng)度接近。 四、在體實(shí)驗(yàn)中ABR閾值及SOD的測(cè)量。 1、ABR閾值：用藥前，兩組ABR反應(yīng)閾比較，差異無(wú)顯著性意義P>0.05；用藥后，兩組ABR反應(yīng)閾比較，差異顯著P<0.01；OPt防治組反應(yīng)閾較自然衰老對(duì)照組低。 2、血清及耳蝸S

12、OD含量：OPC防治組與自然衰老對(duì)照組血清及耳蝸SOD含量相比較，均有顯著性差異P<0.01；OPC防治組血清及耳蝸SOD活性增強(qiáng)。 3、耳蝸基底膜外毛細(xì)胞的缺失：OPC組和自然衰老對(duì)照組耳蝸中間部位均無(wú)明顯的毛細(xì)胞缺失，頂回接近頂端的外毛細(xì)胞均有缺失，但兩組間無(wú)顯著性差異P>0.05；對(duì)照組底回外毛細(xì)胞缺失約為14％，OPC防治組底回相同部位外毛細(xì)胞缺失率約為7％，二者有顯著性差異P<0.01。 五、RT-PCR檢測(cè)離

13、體血管紋細(xì)胞Isk mRNA的表達(dá)血管紋細(xì)胞可見(jiàn)到IskmRNA于368bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶，正常培養(yǎng)組IskmRNA于368bp出現(xiàn)明顯的強(qiáng)擴(kuò)增帶，H<,2>O<,2>作用后出現(xiàn)明顯減弱的特異性擴(kuò)增帶，H<,2>O<,2>+OPC特異性擴(kuò)增帶較H<,2>O<,2>作用后明顯增強(qiáng)。 研究結(jié)論： 1、短暫的氧化刺激可以激發(fā)耳蝸內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生，使線粒體膜的完整性遭到破壞，從而導(dǎo)致耳蝸Corti器和血管紋的損傷和死亡。