衣藻葉綠體中表達(dá)豆血紅蛋白lba基因?qū)ζ洚a(chǎn)氫影響的初步研究.pdf

1、模式生物萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)遺傳學(xué)背景清晰、培養(yǎng)容易、生長(zhǎng)速度快、實(shí)驗(yàn)操作容易，尤其是其氫化酶活性高、能利用太陽能和水生產(chǎn)氫氣而被認(rèn)為是非常有開發(fā)潛力的生物制氫的模式藻種。 目前利用衣藻產(chǎn)氫的最大障礙是氫化酶對(duì)氧氣敏感，這導(dǎo)致衣藻產(chǎn)氫效率低，達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。所以，從分子水平研究衣藻產(chǎn)氫代謝機(jī)理和利用基因工程手段提高衣藻產(chǎn)氫效率是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，最終目的是通過提高氫化酶的氧耐受性或者

2、降低細(xì)胞內(nèi)氧濃度以及提高電子傳遞效率來達(dá)到提高產(chǎn)氫效率的目的。 目前降低衣藻細(xì)胞內(nèi)氧濃度的方法主要是使用缺硫培養(yǎng)基，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中缺硫?qū)е乱略迦~綠體光合系統(tǒng)H(PSⅡ)的D1蛋白修復(fù)受阻，抑制光解水產(chǎn)氧，使衣藻細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)而產(chǎn)氫，但抑制PSⅡ光解水產(chǎn)氧的同時(shí)也抑制了光解水所釋放的電子，而實(shí)驗(yàn)證明光合電子對(duì)產(chǎn)氫非常重要，所以抑制PsⅡ活性最終也導(dǎo)致產(chǎn)氫率下降。 本實(shí)驗(yàn)嘗試將能與氧可逆結(jié)合的大豆血紅蛋白的基因lba轉(zhuǎn)入衣藻

3、的葉綠體中表達(dá)，希望通過lba蛋白的表達(dá)幫助降低葉綠體內(nèi)氧氣含量，增加產(chǎn)氫酶Hase活性；同時(shí)結(jié)合部分恢復(fù)PSⅡ活性以增加電子供應(yīng)量，實(shí)現(xiàn)PSⅡ和氫化酶同時(shí)最大限度行使其功能，實(shí)現(xiàn)高效且持續(xù)產(chǎn)氫的設(shè)想。 本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下： ①提取大豆的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，從cDNA中克隆出了豆血紅蛋白基因lba，lbc1，、lbc2、Ftbr。并成功構(gòu)建了衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化表達(dá)載體cg401-1-lba。 ②利用基

4、因槍法將載體cg401-1-lba轉(zhuǎn)入到衣藻葉綠體中，通過壯觀霉素篩選及繼代培養(yǎng)，獲得葉綠體轉(zhuǎn)化突變株。 ③通過PCR及RT—PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因衣藻進(jìn)行DNA及RNA水平的檢測(cè)，確認(rèn)質(zhì)粒cg401-1-lba已成功轉(zhuǎn)化到衣藻葉綠體中，并整合到葉綠體DNA上，獲得正確轉(zhuǎn)錄。 ④通過WesternBlotting方法對(duì)轉(zhuǎn)基因衣藻進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)，確認(rèn)lba基因在衣藻葉綠體中得到表達(dá)。 ⑤對(duì)轉(zhuǎn)lba基因的衣藻生長(zhǎng)情況

5、進(jìn)行檢測(cè)表明：在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí)，轉(zhuǎn)基因藻849-lba的OD750為2.7，比849低了20％左右；細(xì)胞數(shù)比849低了1.0×106個(gè)/ml；葉綠素含量比848低了約11％。說明lba基因的轉(zhuǎn)入在一定程度上影響了衣藻的生長(zhǎng)。 ⑥利用高效氣相色譜分析儀檢測(cè)轉(zhuǎn)lba基因衣藻的產(chǎn)氫效率，結(jié)果表明在TAP培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因藻lba的氧氣含量降到5％，比849低了1-4倍，轉(zhuǎn)基因藻的產(chǎn)氫量達(dá)到91μ1，比849的產(chǎn)氫量高出50％。在TAP—S