新生大鼠缺氧缺血性腦損傷對松果體功能的影響及外源性褪黑素的神經(jīng)保護作用研究.pdf

1、第一篇新生大鼠缺氧缺血性腦損傷改良模型的建立和鑒定
　　 目的：本研究通過改良Rice的HIBD新生大鼠模型，建立穩(wěn)定可靠的新生大鼠中、重度缺氧缺血性腦損傷動物模型，應用多種方法鑒定建模是否成功，降低傳統(tǒng)制模方法中實驗大鼠的死亡率，為HIBD的進一步研究提供可靠的實驗動物模型。
　　 方法：取7日齡新生Sprague—Dawley(SD)大鼠，隨機分三組，改良的HIBD模型(G組)、傳統(tǒng)的Rice模型(C組)和對照組(S

2、組)，分別于建模后6小時、48小時、72小時取材，觀察模型鼠行為改變、大腦解剖標本并使用HE染色、免疫組化、細胞凋亡鑒定建模成功與否。
　　 結果：
　　 1．G組鼠建模時普遍出現(xiàn)全身性抽搐、右側肢體抽搐、角弓反張及身體自發(fā)性左旋；而C組鼠只有少部分出現(xiàn)右下肢癱瘓及抽搐。
　　 2．G組SD大鼠左側大腦半球呈現(xiàn)出現(xiàn)水腫、蒼白、液化壞死的發(fā)生率約為63％，明顯萎縮率達91％：C組建模后72小時仍無空洞及液化形成。C

3、組與G組比較，左腦皮質及海馬區(qū)水腫程度較輕，神經(jīng)元數(shù)目減少不明顯。
　　 3．G組HIBD后6小時可見左腦皮質NSE著色細胞呈現(xiàn)減少趨勢，48小時NSE酶活性喪失達到高峰，72小時NSE酶活性漸恢復。G組HIBD后48小時凋亡最明顯，72小時凋亡細胞及神經(jīng)細胞數(shù)目仍減少，與C組比較有顯著性差異(p＜0.01)。
　　 4．G組在缺氧結束后未見動物死亡。C組麻醉過程中死亡4只，缺氧過程中死亡8只。存活率有顯著性差異(P＜0

4、.01)。
　　 結論：
　　 多種方法學鑒定了改良后的Rice建模方法在實驗動物死亡率低、成功率高的基礎上可以成功建立中、重度缺氧缺血性腦損傷動物模型。
　　 第二篇新生大鼠缺氧缺血性腦損傷對松果體功能的影響
　　 目的：本實驗通過觀察松果體中褪黑素(MLT)合成酶芳香烷基胺—N—乙酰基轉移酶(AANAT)、羥基吲哚—O—甲基轉移酶(HIOMT)信使核糖核酸(mRNA)的表達，誘生型一氧化氮合酶(ind

5、uceNitricOxideSynthase，iNOS)的表達與細胞凋亡的關系，了解松果體功能與HIBD的關系；放射性免疫法測定外周血MLT水平。
　　 方法：
　　 將SPF級7日齡Sprague—Dawley(SD)隨機分組，HIBD組(T)和假手術組(S)各30只，模型完成后第6、12、24、48、72小時5個時間點取松果體標本和心臟采血，每個時間點6只。電鏡觀察松果體形態(tài)學改變，測定各組不同時間點松果體中AANA

6、TmRNA、HIOMTmRNA的表達。觀察松果體細胞的iNOS表達及細胞凋亡，放免法測外周血MLT的濃度。
　　 結果：
　　 1．松果體中AANATmRNA的表達水平：HIBD后12小時、24小時、48小時AANATmRNA的表達水平均低于對應假手術組；縱向比較各假手術組之間AANATmRNA的表達水平無明顯變化，HIBD后12小時開始下降，24小時達低峰，48小時有所回升，72小時恢復。
　　 2．松果體中H

7、IOMTmRNA的表達水平：與對應假手術組相比，HIBD后各組HIOMTmRNA的表達水平無明顯變化；縱向比較假手術各組之間及HIBD后各組之間HIOMTmRNA的表達水平均無明顯變化。
　　 3．iNOS：新生鼠腦損傷后松果體的iNOS6小時、48小時含量與對應假手術組相比明顯升高。
　　 4．細胞凋亡：腦損傷后松果體凋亡細胞早期明顯增多，尤以6小時、48小時為主。
　　 5．電鏡觀察：腦損傷后松果體的形態(tài)學亦

8、以6小時、48小時改變?yōu)槊黠@，出現(xiàn)線粒體明顯腫脹、粗面內質網(wǎng)極度擴張、細胞變性。
　　 6．血清MLT水平：與對應假手術組相比，HIBD后24小時，48小時血清MLT濃度水平降低；縱向比較假手術各組MLT濃度水平無明顯變化，HIBD后24小時下降，48小時MLT水平與24小時基本相等，72小時恢復正常。
　　 結論：
　　 1．HIBD可導致松果體中褪黑素合成的關鍵酶AANAT的基因表達下降，HIBD后12小時開

9、始下降，24小時達低峰，48小時回升，72小時恢復正常；HIBD后松果體中褪黑素合成的最后一個酶HIOMT的基因表達水平變化不明顯。
　　 2．HIBD可導致外周血MLT濃度減低，24小時開始下降，持續(xù)至48小時，72小時恢復。降低了MLT的內源性保護作用可能參與早期HIBD的發(fā)病機制。
　　 3．HIBD早期松果體功能下降，下調AANAT的基因表達是HIBD早期松果體功能下降的“引擎”。
　　 4．腦損傷后6小

10、時、48小時松果體細胞的iNOS表達增加，以后逐漸下降，72小時基本恢復。
　　 5．TUNEL法原位檢測細胞凋亡與iNOS表達同步改變，iNOS表達對細胞凋亡有促進作用。iNOS表達和TUNEL法細胞凋亡參與了新生鼠缺氧缺血性腦損傷后松果體細胞形態(tài)學改變。
　　 第三篇外源性褪黑素對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的神經(jīng)保護作用研究
　　 目的：探討褪黑素(melatonin，MLT)對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(hyp

11、oxic—ischemicbrain damage，HIBD)的神經(jīng)保護作用以及MLT的用藥時間窗。
　　 方法：
　　 選用7日齡的SD大鼠，隨機分為假手術組(sham組)、模型組(HIBD組)、MLT治療組(按給藥時間分為HIBD前組、HIBD后0小時組、HIBD后1小時組、HIBD后2小時組)。建立新生鼠HIBD模型后，于不同時間點取材，腦組織分別行HE染色觀察組織病理變化，原位末端標記技術(terminal de

12、oxynucleotidyl transferasemediated dUDP—biotin nick end labeling，TUNEL)檢測皮質及海馬神經(jīng)元的凋亡，免疫組化法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neurone specific enolase，NSE)的表達，心臟采血分離血清后用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme—linked immunosorbentassay，ELISA)檢測NSE的水平，并比較各組之間的差異。
　　

13、 結果：
　　 1．TUNEL，法顯示皮質和海馬神經(jīng)元的凋亡細胞于缺氧缺血后6小時漸增多，24小時達高峰，然后逐漸下降，MLT治療組組間存在差異，但各組在6小時、12小時、24小時、48小時、72小時均顯著低于HIBD組(p＜0.01)。
　　 2．腦組織中NSE的變化與血清中NSE的變化顯著相關(r=—0.92)，NSE在缺氧缺血后6小時開始升高，24小時達高峰后漸回落，MLT治療組組間存在差異，但各組在6小時、12小

14、時、24小時、48小時、72小時均顯著優(yōu)于HIBD組(p＜0.01)。
　　 3．MLT治療組組間比較，HIBD前組、HIBD后0小時組、HIBD后1小時組各項指標的變化差異性不明顯(p＞0.05)，但它們與HIBD后2小時組在各項指標的變化上有顯著性差異(p＜0.05)。
　　 結論：
　　 1．褪黑素對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷有預防和治療作用。
　　 2．腦組織中NSE的變化與血清中NSE的變化有顯著