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文檔簡(jiǎn)介
1、背景和目的:
新生兒缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指各種圍生期高危因素引起腦組織不同程度缺氧、血流減少甚至中斷,導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,是新生兒死亡及遺留腦性癱瘓、癲癇、智力障礙、行為缺陷等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因,因此HIBD的早期干預(yù)成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。枸櫞酸咖啡因(caffeine citrate,CC)屬于甲基黃嘌呤類藥物,為非選擇性腺苷受體(adenosi
2、ne receptors,AR)拮抗劑,可透過(guò)血腦屏障,通過(guò)拮抗腺苷受體發(fā)揮生物學(xué)作用,臨床上廣泛用于治療早產(chǎn)兒呼吸暫停(Apnea of premature, AOP)。研究表明,咖啡因不僅可以防治支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD),而且可以降低早產(chǎn)兒后期腦癱及認(rèn)知障礙的發(fā)生率。枸櫞酸咖啡因系通過(guò)直接作用于腦組織起保護(hù)作用還是通過(guò)改善通氣間接發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的,具體機(jī)制目前尚不明確。本
3、實(shí)驗(yàn)采用7日齡新生Sprague-Dawley(SD)大鼠,結(jié)扎左頸總動(dòng)脈并缺氧制備HIBD動(dòng)物模型,治療組給予CC干預(yù)治療,從海馬神經(jīng)細(xì)胞增生與凋亡、腦白質(zhì)髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)表達(dá)及遠(yuǎn)期大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變,探討CC對(duì)新生大鼠腦組織的保護(hù)作用,并進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)CC對(duì)缺氧缺血后腦組織腺苷A1受體(Adenosine1 Receptors,A1R)mRNA和腺苷A2a受體(Adenosine<
4、br> 2a Receptors,A2aR)mRNA表達(dá)的影響,探討CC對(duì)新生大鼠HIBD的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。
材料與方法:
72只7日齡新生SD大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組、HIBD組、CC組,每組24只。假手術(shù)組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈,不結(jié)扎不缺氧;HIBD動(dòng)物模型制備參照Rice法,HIBD組和CC組均結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈,然后放于母鼠身旁恢復(fù)1 h,進(jìn)而置于37℃恒溫的容器中,通入80 mL/L氧氣和920 m L/
5、L氮?dú)獾幕旌蠚怏w2 h。CC干預(yù)組在缺氧缺血(Hypoxic-ischemic,HI)前、HI后0min、24h、48h、72h腹腔注射20mg/kg的CC,假手術(shù)組和HIBD組等時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積的生理鹽水。至12日齡時(shí)每組處死16只大鼠,余飼養(yǎng)至28日齡:(1)在12日齡處死前各組隨機(jī)選取8只新生大鼠,分別腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)標(biāo)記新生細(xì)胞,劑量為50mg/kg,1次/12
6、h,連續(xù)5次,最后一次腹腔注射BrdU4h后斷頭取腦,采用HE染色對(duì)各組大鼠腦組織HI側(cè)CA1區(qū)光鏡下行病理學(xué)觀察,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HI側(cè)腦組織海馬齒狀回顆粒下層BrdU、海馬CA1區(qū)活化半胱氨酸基天冬氨酸酶-3(Cleaved cysteine aspartic acid specific protease,活化 Caspase-3)、皮層下白質(zhì)MBP的表達(dá)水平,TUENL法檢測(cè)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞;(2)至12日齡時(shí),各組隨機(jī)選取
7、8只新生大鼠,采用Real Time PCR測(cè)定HI側(cè)腦組織A1R mRNA、A2aR mRNA的水平;(3)余大鼠至28日齡時(shí)采用Y迷宮進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)。
結(jié)果:
1.各組新生大鼠HI側(cè)腦組織海馬區(qū)病理學(xué)觀察
假手術(shù)組大鼠HI腦海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞層次清晰,形態(tài)正常;HI后腦組織出現(xiàn)不同程度的病理學(xué)改變,HIBD組表現(xiàn)為細(xì)胞排列紊亂、邊界不清;CC干預(yù)組較HIBD組細(xì)胞層次相對(duì)清晰,排列整齊。
8、
2.各組新生大鼠 HI側(cè)腦組織海馬齒狀回BrdU、海馬CA1區(qū)活化Caspase-3及TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞、皮層下白質(zhì)MBP的表達(dá)情況
HIBD組、CC組、假手術(shù)組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為56.50±0.91、59.10±0.54、41.25±1.27,前兩組均高于假手術(shù)組( P<0.05),而前兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);各組活化 Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)高低依次為HIBD組、CC組、假手術(shù)組,分別
9、為:52.38±1.60、25.88±0.64、14.00±0.27,三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);假手術(shù)組海馬CA1區(qū)可見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(9.13±0.35),HIBD組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(37.38±0.94)最多,CC組(14.75±0.56)較HIBD組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少,三組間兩兩相比有差異(P<0.05);HIBD組較假手術(shù)組皮層下白質(zhì)MBP(用IOD值表示)明顯減少(P<0.05),給予CC干預(yù)后,MBP
10、表達(dá)水平較HIBD組升高(P<0.05)。
3.各組大鼠HI側(cè)腦組織A1R mRNA、A2aR mRNA的表達(dá)
HI后A1R mRNA較假手術(shù)組顯著上調(diào)(1.28±0.34 vs1.02±0.18)(P<0.05),而A2aR mRNA變化不明顯(1.13±0.36 vs1.09±0.21)(P>0.05),給予CC干預(yù)后A1R mRNA較HIBD組下降(0.94±0.17 vs1.28±0.34),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
11、(P<0.05),而A2aR mRNA下降不明顯(0.96±0.14 vs1.13±0.36)(P>0.05)。
4.各組大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的比較
28日齡時(shí),Y迷宮測(cè)試顯示大鼠學(xué)會(huì)逃避電擊次數(shù)由低到高依次為假手術(shù)組(31.25±1.41)、CC組(39.75±2.51)、HIBD組(58.50±3.14),三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);記憶保持能力高低依次為 CC組(85.00±3.27)、假手
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