基于GC-GR介導(dǎo)的NF-κB-IκB信號(hào)通路探討激素依賴性皮炎發(fā)病機(jī)制及昆明山海棠的干預(yù)作用.pdf

1、背景：
　　激素依賴性皮炎（HDD）是外用糖皮質(zhì)激素（GC）在局部皮膚不規(guī)范應(yīng)用引起的炎癥性皮膚病，目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床亦無(wú)滿意治療方法。
　　外用GC是激素依賴性皮炎產(chǎn)生的初始原因，因?yàn)?GC是通過(guò)與胞內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合相互作用的，因此激素依賴性皮炎的發(fā)病機(jī)制顯然與GC-GR間相互作用有關(guān)。
　　研究發(fā)現(xiàn)，在激素依賴性皮炎發(fā)生的過(guò)程中存在著大量炎癥細(xì)胞因子的釋放，而炎癥細(xì)胞因子的聚集、表達(dá)可能和多個(gè)

2、信號(hào)傳導(dǎo)通路活化有關(guān)，其中NF-κB/IκB信號(hào)通路對(duì)免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)最受關(guān)注。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，GR和NF-κB在對(duì)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的調(diào)控中是一對(duì)功能上相互拮抗的重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NF-κB可介導(dǎo)多種與免疫和炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子和介質(zhì)的活化過(guò)程，而GR則可抑制NF-κB活化基因的表達(dá)。
　　據(jù)此，我們推測(cè)：GR介導(dǎo)的NF-κB/IκB信號(hào)通路在調(diào)控激素依賴性皮炎的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著核心作用。
　　昆明山海棠（THH）是

3、一種具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等作用的中藥，廣泛應(yīng)用于各種過(guò)敏性疾病、自身免疫性疾病的治療。近年來(lái)臨床研究發(fā)現(xiàn)，昆明山海棠治療激素依賴性皮炎取得較好的療效，可以明顯降低停藥后的復(fù)發(fā)率，可是其具體作用機(jī)制不清。我們推測(cè)：昆明山海棠可能通過(guò)上述信號(hào)通路調(diào)控、抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，起到抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)擬以激素依賴性皮炎豚鼠作為研究模型，以該模型炎癥反應(yīng)過(guò)程為研究主線，以GR、NF-κB為研究靶點(diǎn)，從信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)層面，研

4、究激素依賴性皮炎發(fā)生過(guò)程中GR、NF-κB及其上下游調(diào)控的細(xì)胞因子（IL1、IL-4、TNF-α）表達(dá)的變化和規(guī)律，為闡明激素依賴性皮炎的發(fā)生機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。以昆明山海棠為干預(yù)手段，對(duì)其抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理進(jìn)行初步探討，為優(yōu)化臨床治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　通過(guò)建立激素依賴性皮炎豚鼠模型，對(duì)GC/GR介導(dǎo)的NF-κB/IκB信號(hào)通路關(guān)鍵分子進(jìn)行測(cè)定，初步探討激素依賴性皮炎的發(fā)病分子機(jī)制。并觀察昆明山海棠對(duì)激素

5、依賴性皮炎豚鼠 NF-κB/IκB信號(hào)通路的影響，為該藥的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.通過(guò)外用0.02％丙酸氯倍他索軟膏建立激素依賴性皮炎動(dòng)物模型。
　　2.將36只豚鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、造模組（造模7d組，造模15d組，造模21d組，造模28d組）和GR阻斷組，每組6只。4組造模組分別在造模第7天、第15天（停藥）、21天（停藥后6天）、28天（停藥后13天）進(jìn)行心臟穿刺取血，采用ELISA法測(cè)定血

6、清IL-1、IL-4含量；取背部實(shí)驗(yàn)區(qū)皮膚組織，應(yīng)用免疫組化法測(cè)定NF-κBp65、IκB蛋白表達(dá)水平，采用RT-PCR法檢測(cè)GRmRNA、TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄水平。觀察這些指標(biāo)在不同造模階段的變化規(guī)律。
　　3. GR阻斷組在外用激素15d停藥后，按20mg/kg體重皮下注射濃度為10g/L的RU486(米非司酮)油劑,1次/d，連續(xù)6d。第21d脫頸椎處死動(dòng)物，取背部實(shí)驗(yàn)區(qū)皮膚組織，用SABC免疫組化技術(shù)檢測(cè)NF-κB和Iκ

7、B的表達(dá)水平，并與同期處死的造模21d組的NF-κB、IκB的表達(dá)水平比較。觀察GR阻斷后對(duì)NF-κB和IκB的表達(dá)的影響。
　　4.48只豚鼠，隨機(jī)抽取40只建立激素依賴性皮炎模型，將造模成功后的豚鼠模型隨機(jī)分為5組，即模型組、小劑量昆明山海棠組、中劑量昆明山海棠組、大劑量昆明山海棠組和外用激素遞減對(duì)照組。剩余8只豚鼠作為空白對(duì)照。
　　空白組、模型組均外涂凡士林，每天涂抹1次；外用激素遞減對(duì)照組：開(kāi)始第1周用0.1%丁酸

8、氫化可的松乳膏于造模區(qū)皮膚均勻涂抹，2次/d；第2周，1次/d；第3周，隔天1次；第4周，3天1次；小劑量昆明山海棠組、中劑量昆明山海棠組、大劑量昆明山海棠組分別按1ml/kg、2ml/kg、4ml/kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃給藥，每天1次。各組均用藥4周后停藥，5天后分別測(cè)定血清IL-1、IL-4含量；皮膚組織NF-κBp65、IκB蛋白表達(dá)水平及 GRmRNA、TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄水平。觀察不同干預(yù)條件下這些指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：

9、>　　1.造模組與空白對(duì)照組比較，血清IL-1、 IL-4在造模組中的7d組、15d組呈下降趨勢(shì)，在停藥后的21d組、28d組逐漸升高。其中28d組血清IL-1含量明顯高于正常對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.造模組與空白對(duì)照組比較，皮膚組織NF-κB的表達(dá)在造模組中的7d組、15d組呈下降趨勢(shì)，在停藥后的21d組明顯升高，28d組略有下降，與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，皮膚組織I

10、κB在造模組中的7d組、15d組呈上升趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在停藥后的21d組、28d組逐漸下降，但表達(dá)量仍然高于空白對(duì)照組。
　　3. GRαmRNA的表達(dá)在造模組中的7d組有所升高，隨后呈下降趨勢(shì)，直到停藥后的28d組略有升高。其中15d組、21d組、28d組GRα mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，皮膚組織TNF–αmRNA的表達(dá)在造模組中的7d組、15d

11、組呈下降趨勢(shì)，在停藥后的21d組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。28d組逐漸下降，但表達(dá)量仍然高于空白對(duì)照組。
　　4. GR阻斷組與與空白組及同期的21d組比較，NF-κBp65表達(dá)均明顯增高，而IκB均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　5.治療四周后，與模型組比較，激素遞減組與昆明山海棠組血清IL-1、IL-4、皮膚組織NF-κB、TNF–αmRNA均有不同程度下降。昆明山海棠組隨著劑量的增

12、加，抑制效果越明顯，其中高劑量昆明山海棠組血清IL-1、IL-4、NF-κB、TNF–αmRNA表達(dá)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，激素遞減組與各昆明山海棠組，皮膚組織IκB表達(dá)均有不同程度升高。其中激素遞減組和高劑量昆明山海棠組可明顯增加 IκB表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　6.治療四周后，與模型組比較，激素遞減組可明顯降低皮膚組織GRαmRNA水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05

13、）。各昆明山海棠組則對(duì)GRα mRNA水平?jīng)]有明顯影響（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在激素依賴性皮炎豚鼠模型中，長(zhǎng)時(shí)間外用強(qiáng)效 GC，可降低涂藥區(qū)皮膚組織GR水平，并可使GR在停藥后仍較長(zhǎng)時(shí)間維持低水平表達(dá)。GC可同時(shí)可激活I(lǐng)κB，抑制NF-κB表達(dá)，抑制血清IL1、TNF-α等前炎癥因子水平，從而抑制炎癥的發(fā)生。
　　2.進(jìn)行 GR阻斷后，GR阻斷組與同時(shí)期模型組對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的活性有明顯增高，I

14、κB表達(dá)則明顯減少。表明在激素依賴性皮炎情況下，GR減少可抑制 IκB的表達(dá)，增強(qiáng) NF-κB的活性表達(dá)，從而加重激素依賴性皮炎炎癥狀況。亦說(shuō)明正常功能狀態(tài)的 GR可抑制 NF-κB誘導(dǎo)的免疫和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。由此推測(cè)：激素依賴性皮炎的發(fā)生與GR長(zhǎng)時(shí)間的低水平表達(dá)，抑制 IκB表達(dá)，從而激活NF-κB/IκB通路有關(guān)。
　　3.昆明山海棠能以濃度依賴方式抑制激素依賴性皮炎豚鼠血清 IL-1、IL-4水平，抑制皮膚組織TNF–α