香菇C-,91-3-菌絲發(fā)酵液蛋白（LFP-,91-3C-）的提取及其抗腫瘤作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：大型真菌作為藥物使用在我國已有近千年的歷史，它們普遍具有降低膽固醇、降血壓等多種藥理活性，尤其是它們的抗腫瘤作用最受人們關(guān)注。香菇[1entinusedodes(berk)sing]，屬真菌門，它是世界上著名的食用真菌之一。近十年，國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者對香菇抗腫瘤作用進(jìn)行了大量研究。目前，大多研究角度為：1、香菇子實(shí)體及其提取物的相關(guān)研究。而有關(guān)香菇菌絲發(fā)酵液及其提取物的研究較少。以香菇子實(shí)體作為研究對象，子實(shí)體的生長周期大約為10個月

2、，費(fèi)時費(fèi)力。香菇C91-3是我課題組經(jīng)多年篩選的一株其發(fā)酵液具有抗腫瘤、抗細(xì)菌作用的真菌，此發(fā)酵液中含有的多糖和氨基酸成分與子實(shí)體相似，但其發(fā)酵周期只需要5-7天，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。2、香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)研究，有關(guān)香菇蛋白的抗腫瘤作用鮮有報道。利用蛋白質(zhì)基本性質(zhì)，我課題組對香菇C91-3發(fā)酵液中的蛋白進(jìn)行了初步提取并進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗，顯示此蛋白既具有體內(nèi)抗腫瘤作用，亦具有體外直接殺傷腫瘤細(xì)胞作用。同時，我們也意識到香菇作為

3、廣泛應(yīng)用的藥用真菌，深入研究其有益蛋白組分有著重要的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用意義。 方法：立足于前期研究基礎(chǔ)之上，進(jìn)行如下工作：利用凝膠層析技術(shù)分離香菇C91-3發(fā)酵液中提取的粗蛋白(LFP91-3)。按蛋白的分子量大小將提取蛋白分成3個組分(a、b和c)，經(jīng)體外活性實(shí)驗，證實(shí)C段蛋白(LFP91-3C)是抗腫瘤作用效果最強(qiáng)的蛋白組分，大量提取純化進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗。 (一)LFP91-3C對荷瘤小鼠的生存期影響的實(shí)驗取24只BALB/

4、C小鼠，分別予H22細(xì)胞(腹水型肝癌細(xì)胞株)腹腔荷瘤，荷瘤后隨機(jī)將之分為3組：生理鹽水(NS)組、環(huán)磷酰胺(CTX)組、LFP91-3C組。每組8只，荷瘤24小時后分別予以NS和CTX各0.4mg、LFP91-3C100μg每日一次，每次1ml/只，腹腔注射，連續(xù)5日。分別觀察三組腫瘤細(xì)胞荷瘤小鼠的生存期。 (二)LFP91-3C對實(shí)體瘤塊生長的影響及病理觀察取24只BALB/C小鼠，分別予H22細(xì)胞右腋皮下荷瘤。分組及其用藥劑

5、量同上，右腋皮下注射小鼠，每日一次，連續(xù)10日。于接種腫瘤細(xì)胞后第13日處死小鼠，取瘤組織稱重，并用福爾馬林溶液固定，制備病理切片。研究LFP91-3C對荷瘤小鼠的抑瘤作用及機(jī)制。 (三)LFP91-3C對荷瘤小鼠免疫細(xì)胞和免疫因子的影響建立小鼠模型、分組和給藥同組(一)。于接種腫瘤細(xì)胞第12天，各組小鼠分別摘除眼球取血，之后脫頸處死取脾。(1)NK細(xì)胞活性測定：將脾細(xì)胞放入Hanks液中剪成糊狀，200目不銹鋼細(xì)胞網(wǎng)過濾分成單

6、個脾細(xì)胞，用Hanks液洗滌，調(diào)整濃度5×106/ml。96孔板中按實(shí)驗孔、效應(yīng)細(xì)胞對照孔、靶細(xì)胞對照孔分別加入脾細(xì)胞和YAC-1細(xì)胞各100μg，各設(shè)3個復(fù)孔，置37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)20小時，離心棄上清，各孔加MTT應(yīng)用液10μl，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時，加入溶解液MDSO100μl，充分吹打使紫色結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀測吸光OD值。(2)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗：按上述方法取脾細(xì)胞，將制備好的脾細(xì)胞，加入96孔板，每孔20

7、0μl，每個實(shí)驗孔再加ConA(50μg/ml)20μl，對照孔RPMI-1640培養(yǎng)液20μl，各設(shè)3個復(fù)孔，于37℃，5﹪CO2溫箱中培養(yǎng)68小時，離心1000r/min10min，吸棄上清100μl，加MTT液10μl，培養(yǎng)4小時，加DMSO液100μl，充分吹打使紫色結(jié)晶完全溶解后使用酶標(biāo)儀測OD值。(3)荷瘤小鼠血清IL-2含量的測定：如上所述摘除小鼠眼球取血，制備血清，用小鼠IL-2ELISA檢驗試劑盒，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免

8、疫檢測法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本中IL-2的含量。(4)荷瘤小鼠血清IFN-γ含量測定：方法同(3)。 結(jié)果：1.LFP91-3C能延長荷瘤小鼠的生存期，抑制腫瘤生長。對由H22腫瘤細(xì)胞所致的腹水型荷瘤小鼠，LFP91-3C組的存活期的平均值為：22.88天，較NS組13.25天(P＜0.05)和CTX組17.63天(P＜0.05)有顯著延長。 2.LFP91-3C能抑制小鼠體內(nèi)實(shí)體腫瘤生長，

9、LFP91-3C組的抑瘤率為70.32﹪，CTX組抑瘤率為24.95﹪，LFP91-3C組抑瘤效果顯著強(qiáng)于CTX組(P＜0.05)。病理切片上可見：NS對照組腫瘤組織生長旺盛，侵犯周圍組織，腫瘤細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞體積較大，核增大，可見巨核、多核現(xiàn)象，核分裂像增多，局部有壞死。LFP91-3C組作用后腫瘤組織生長明顯受抑制，腫瘤組織內(nèi)部和間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，而且可見局部有大片壞死。 3.LFP91-

10、3C能顯著提高荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫。(1)NK細(xì)胞活性：LFP91-3C組的NK細(xì)胞活性89.67±3.65ng。顯著高于NS組NK細(xì)胞活性65.98±7.16ng。(2)淋巴細(xì)胞增殖率：LFP91-3C組的淋巴細(xì)胞增殖率44.40±4.30ng。顯著高于NS組淋巴細(xì)胞增殖率34.57±3.50ng。(3)荷瘤小鼠血清IL-2和IFN-γ的含量：94.59±5.40ng，51.02±4.51ng。LFP91-3C組的血清IL-2

11、和IFN-γ明顯增加，分別為127.38±3.89ng，66.44±3.66ng。 結(jié)論：本實(shí)驗對香菇C91-3發(fā)酵液中的粗蛋白探索性的利用凝膠層析技術(shù)進(jìn)行了初步提取、分離和純化，按蛋白的分子量大小將提取蛋白分成3個組分(a、b和c)，經(jīng)體外活性實(shí)驗，證實(shí)C段蛋白(LFP91-3C)是抗腫瘤作用效果最強(qiáng)的蛋白組分，并進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗。證實(shí)LFP91-3C能明顯延長荷瘤小鼠的生存期并對實(shí)體腫瘤有明顯抑制作用，還能通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)