香菇C91-3轉(zhuǎn)錄組Latcirpin-3基因的原核表達(dá)、純化及其生物學(xué)活性的研究.pdf

1、背景:惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，已成為重要的致死性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，所以有效治療舉步維艱。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究取得了巨大進(jìn)步，但是大多數(shù)腫瘤仍不能被治愈。惡性腫瘤的發(fā)生受環(huán)境因素和遺傳因素共同影響，在眾多影響腫瘤發(fā)生的因素中，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷及其對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的干擾在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
　　絕大多數(shù)復(fù)雜的生命體都依賴氧而生存，但是氧是一種高活性分子，生物體會分解氧氣產(chǎn)生包括過氧化氫(H2O2)、自由基如羥

2、基自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-)以及脂質(zhì)過氧化物等活性氧(reactive oxygen species，ROS)，這些代謝產(chǎn)物可以直接或間接地對核酸、脂類和蛋白質(zhì)造成暫時或永久性損傷，從而對生物體自身造成損害?；罴?xì)胞中許多的氧化反應(yīng)需要酶催化，氧化反應(yīng)即分子間的氫質(zhì)子或電子轉(zhuǎn)移，這類代謝反應(yīng)是生命過程所需能量的主要來源。
　　氧化-抗氧化狀態(tài)之間的不平衡造成的氧化損傷與眾多疾病的發(fā)生相關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、動脈粥樣

3、硬化、急性呼吸窘迫綜合癥等?；谧陨肀Ｗo(hù)，機(jī)體需要多種類型的抗氧化劑以維持氧化代謝的平衡。如谷胱甘肽、維生素C、維生素E以及一些酶類，包括過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)等?？寡趸缚杀Ｗo(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，抗氧化酶活性和表達(dá)的失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素。

4、　　天然抗氧化劑在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，香菇是著名的藥食兩用菌，開展從香菇中提取抗氧化物質(zhì)的研究有一定的理論和應(yīng)用價值。香菇C91-3菌株是我課題組經(jīng)多年篩選得到的一株藥用真菌。我們前期的實驗證明，香菇C91-3菌株發(fā)酵液具有良好的抗腫瘤、抗菌作用。香菇C91-3菌株發(fā)酵液中含有多種蛋白成分。我們課題組曾對香菇C91-3菌株發(fā)酵液蛋白(LFP91-3)進(jìn)行了初步分離并進(jìn)行體外抗腫瘤實驗研究。研究結(jié)果表明其蛋白成分具有較好的

5、抗氧化，抗腫瘤作用，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這些性質(zhì)均有利于其成為一種良好的臨床藥物。近年來國內(nèi)外腫瘤發(fā)病率有不斷升高的趨勢下，尋求新的毒副作用小、靶向作用強(qiáng)的腫瘤治療藥物，提高腫瘤患者的遠(yuǎn)期生存率，是當(dāng)前迫切需要解決的課題。
　　國外學(xué)者的研究結(jié)果顯示，香菇菌提取物對多種腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用，我們以前的研究中也發(fā)現(xiàn)從真菌中提取的混合蛋白LFP91-3可有效抑制腫瘤的生長，具有直接殺滅腫瘤細(xì)胞、提高機(jī)體免疫力等多重抗腫瘤效應(yīng)，

6、但是這些混合蛋白的成分復(fù)雜，在廣泛的pH范圍和分子量范圍內(nèi)含有大量低濃度的蛋白成分。因此，對香菇C91-3菌株蛋白成分繼續(xù)進(jìn)行深入研究，使之成為良好的臨床抗腫瘤藥物，是我們目前需要解決的問題。為此我們進(jìn)行了香菇C91-3菌株轉(zhuǎn)錄組的研究工作，通過轉(zhuǎn)錄組測序、分析及生物信息學(xué)工具進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的比對、篩選提示有過氧化物酶活性的抗氧化蛋白基因，獲取其基因全長，用生物工程的手段得到該活性蛋白，并驗證其生物學(xué)功能。目前，我們已經(jīng)成功地將選定的目的蛋

7、白在GenBank進(jìn)行了序列注冊GenBank Accession Number: KF682440)，并命名為Latcripin-3。
　　目的:本研究通構(gòu)建香菇C91-3菌株pET32a-Latcripin-3表達(dá)載體，使其在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)菌株中進(jìn)行重組表達(dá)，經(jīng)過親和層析得到單一目的蛋白，并對其生物學(xué)活性的進(jìn)行檢測來尋求香菇C91-3菌株中的活性功能蛋白;同時，通過對此蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比對，闡

8、明其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑，進(jìn)而通過實驗加以驗證。
　?、賹ふ也⒋_定香菇C91-3菌株中抗氧化，抗腫瘤蛋白的基因序列;分析此蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測其空間構(gòu)象及功能基團(tuán)。
　?、谕ㄟ^構(gòu)建pET32a-Latcripin-3表達(dá)載體將香菇C91-3菌株抗氧化、抗腫瘤蛋白Latcripin-3在Rosetta-gami(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá)，同時對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　?、奂兓繕?biāo)蛋白Latcripin-3，研究其對

9、人肺癌細(xì)胞A549生物學(xué)功能影響，探討其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　方法:
　　①從香菇C91-3菌株菌絲體中提取總RNA，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，用3'-FullRACE、5'-Full RACE方法獲得Latcripin-3基因，通過生物信息學(xué)軟件分析Latcripin-3一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、并預(yù)測其功能結(jié)構(gòu)域，對其可能存在的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。
　?、趯atcripin-3基因克隆到表達(dá)載體pET32a(+)中

10、，構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Latcripin-3。用熱轉(zhuǎn)化的方法將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta-gami(DE3)中并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物用Western blot方法和質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。用親和層析的方法分離純化目的蛋白，測定蛋白濃度。
　?、蹖⒁谚b定的各濃度的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白作用于人肺癌細(xì)胞A549，用MTT法測定目的蛋白的抑瘤率;用流式細(xì)胞術(shù)檢測目的蛋白對腫瘤細(xì)胞的凋亡作用及細(xì)胞周期的影響;用電鏡法檢測其對A549細(xì)

11、胞形態(tài)學(xué)影響。
　　結(jié)果:
　?、偻ㄟ^對雙酶切產(chǎn)物核酸電泳和基因序列分析確定插入pET32a中的片段為Latcripin-3基因片段。通過對Latcripin-3進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域的分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白三級結(jié)構(gòu)極為特別，該蛋白具有多個連續(xù)α螺旋結(jié)構(gòu)，最終形成一個口袋樣空間結(jié)構(gòu)。它的上游具有過氧化物酶超家族結(jié)構(gòu)域;下游為DUF3415(Domain ofunknown function)域，為未知生物活性的功能域。
　　②Wes

12、tern blot結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白為含有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)過程中，目的蛋白在加入IPTG后3小時以后完全表達(dá)，表達(dá)的總量隨時間變化相對恒定。通過親和層析，將目標(biāo)蛋白純化成功，蛋白電泳顯示單一的目的條帶。經(jīng)過尿素梯度透析，恢復(fù)該蛋白的空間結(jié)構(gòu)，并使用超濾管離心濃縮蛋白。通過LTQ質(zhì)譜分析，驗證該蛋白的生物學(xué)活性。采用南京凱基BCA檢測蛋白濃度試劑盒測定表達(dá)蛋白濃度為0.736mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=38.845x-2.57

13、91，R2=0.9958。
　?、劭寡趸瘜嶒濴atcripin-3對DPPH自由基清除呈現(xiàn)濃度依賴性，在低濃度(＜60μg/mL)時抗與抗壞血酸的抗氧化無顯著型差異(P＞0.05)。
　　④MTT法檢測結(jié)果顯示，不同作用時間（24小時、48小時），不同蛋白濃度A549細(xì)胞(ATCC(R)CCL185TM)的生長抑制作用(OD495)與對照組比較差異均有顯著性意義(P＜0.05)。7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/m

14、L和60μg/mL目的蛋白的抑瘤率呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性。
　?、萘魇郊?xì)胞凋亡功能結(jié)果顯示，此蛋白終濃度為30μg/mL、60μg/mL具有對A549細(xì)胞早期凋亡的能力，凋亡誘導(dǎo)率與對照組比較差異均有顯著性意義(P＜0.05)，濃度為60μg/mL時誘導(dǎo)凋亡的作用最強(qiáng)。
　?、蘖魇郊?xì)胞周期結(jié)果顯示，隨著Latcripin-3蛋白濃度的增大，G0/G1期所占的比率有降低的趨勢;G2/M期所占比例明顯降低的趨勢，并且在

15、Latcripin-3蛋白濃度達(dá)到60μg/mL時G2/M期所占的比率竟然為0(P＜0.05)。S期所占比例明顯有明顯升高的趨勢，當(dāng)Latcripin-3蛋白濃度達(dá)到30μg/ml和60μg/mlS期比率有顯著性差異(P＜0.05)，生長多停滯于S期。
　?、唠婄R結(jié)果顯示Latcripin-3蛋白作用后的細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，凋亡細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮，胞漿內(nèi)空泡增多，染色質(zhì)固縮、邊集或碎裂成不規(guī)則塊狀，線粒體腫脹。
　　結(jié)論:

16、
　　①對獲得的香菇C91-3菌株的轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對分析，篩選確定了很可能具有抗氧化酶活性的轉(zhuǎn)錄組序列Latcripin-3，根據(jù)此序列設(shè)計引物，用3'-FullRACE（Rapid Amplificatioon of cDNA Ends）、5'-Full RACE方法成功獲得了Latcripin-3基因全長;通過分析此蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測了其空間構(gòu)象及功能基團(tuán)。Latcripin-3蛋白具有兩個功能域:一個具有過氧化

17、物酶結(jié)構(gòu)域，和一個未知的DUF3415結(jié)構(gòu)域，其生物學(xué)功能可能通過這兩個結(jié)構(gòu)域共同發(fā)揮作用。
　?、诔晒?gòu)建了重組質(zhì)粒pET32a(+)-Latcripin-3;并在大腸桿菌Rosetta-gammi(DE3)宿主中成功表達(dá);目的蛋白Latcripin-3經(jīng)親和層析被成功純化，為進(jìn)一步研究Latcripin-3的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　?、巯愎紺91-3菌株轉(zhuǎn)錄組蛋白Latcripin-3具有清除自由基的抗氧化活性; La