具有蛋白酶體抑制劑活性的天然藥物對轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞HBV的抑制作用.pdf

1、背景:
　　 乙型肝炎病毒(HBV)在慢性乙型肝炎(CHB)患者體內(nèi)持續(xù)復(fù)制，可以引起肝臟炎癥和纖維化，嚴(yán)重者可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，已成為嚴(yán)重的社會和公共衛(wèi)生問題?？共《局委熓锹砸倚透窝字委煹年P(guān)鍵已成共識。核苷（酸）類似物成為繼干擾素α(IFN-α)之后的又一類用于抗乙型肝炎病毒的有效治療藥物。但大多數(shù)接受核苷（酸）類似物治療的患者難以通過短期的治療來實現(xiàn)持久性應(yīng)答，故常需要接受長期治療，這就進一步增加了病毒耐藥的風(fēng)險，并且

2、隨著核苷（酸）類似物種類的不斷增多，HBV耐藥變異的復(fù)雜性也逐漸增加。因此，如何有效清除HBV或持續(xù)長期抑制HBV的復(fù)制，減少病毒耐藥的發(fā)生，是目前抗病毒治療工作的重點和難點。隨著人們對病毒復(fù)制與宿主細胞分子之間關(guān)系認(rèn)識的逐漸加深，最近專家提出一種以宿主細胞為靶位的新的抗病毒策略——通過調(diào)節(jié)病毒復(fù)制各個階段所依賴的相關(guān)宿主細胞蛋白，從而達到抑制病毒復(fù)制、減少病毒耐藥的目的。有研究發(fā)現(xiàn)親環(huán)素A的抑制劑可以有效干擾病毒RNA的復(fù)制，這一發(fā)現(xiàn)

3、并被用于指導(dǎo)丙型肝炎病毒(HCV)抗病毒治療的研究。
　　 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解是生物體內(nèi)十分重要的過程，主要包括溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑。溶酶體途徑是一個非選擇性的降解蛋白質(zhì)的過程，發(fā)生在溶酶體內(nèi);泛素-蛋白酶體途徑是一個選擇性的降解蛋白質(zhì)的過程，通過選擇性的降解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，從而控制著體內(nèi)許多重要的生物學(xué)過程。大量的研究表明病毒可以通過利用宿主細胞的泛素-蛋白酶體途徑逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控、促進病毒的復(fù)制以及病毒粒子的組裝

4、與釋放。有研究報道蛋白酶體抑制劑硼替佐米在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)可以有效的抑制HBV-DNA的復(fù)制，但對HBsAg的抑制作用不明顯;而本實驗室之前研究工作亦發(fā)現(xiàn)硼替佐米在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞水平不但可以抑制HBV-DNA的復(fù)制，而且可以有效抑制HBsAg的表達。因此，蛋白酶體抑制劑的抑制作用是否具有普遍性的意義需要做進一步的研究加以證實。
　　 一直以來，用于評價某種藥物對HBV作用效果較為公認(rèn)的理想細胞模型是HepG2.2

5、.15細胞，但由于HepG2.2.15細胞來源于肝癌細胞系，而蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體的生物學(xué)活性，可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。因本實驗研究藥物的特殊性， HepG2.2.15細胞無法作為本實驗研究的理想細胞模型。我們實驗室在本中心自行建立的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠基礎(chǔ)上通過新改良的兩步灌流法分離出HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞。經(jīng)長時間的觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)此方法分離培養(yǎng)的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞活細胞比例高、細胞活力好，培養(yǎng)24小時后，貼壁的原代肝細

6、胞基本恢復(fù)了由于膠原酶消化對細胞膜造成的部分損害，并且在培養(yǎng)的前5天，細胞具有良好的合成白蛋白的能力，并可以穩(wěn)定的表達HBsAg和HBV-DNA。因此，本研究采用新分離的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞作為實驗研究的細胞模型。評價具有蛋白酶體抑制劑活性的天然藥物——雷公藤紅素對轉(zhuǎn)基因小鼠HBV的抑制作用。
　　 目的:
　　 利用本中心自行構(gòu)建的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，采用新改良的兩步灌流法分離HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞，在原代肝細

7、胞水平評價雷公藤紅素對轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞HBV的抑制作用。
　　 方法:
　　 1)采用新改良的兩步灌流法分離的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞，培養(yǎng)24h后，用濃度分別為20μmol·L-1、4μmol·L-1、0.8μmol·L-1、0.16μmol·L-1、0.032μmol·L-1、0.0064μmol·L-1、0.00128μmol·L-1、0.000256μmol·L-1的雷公藤紅素作用于HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細

8、胞，24h后取培養(yǎng)上清，常規(guī)MTT法檢測不同濃度的雷公藤紅素對轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞的細胞毒性作用。
　　 2)新分離的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞培養(yǎng)24h后，取最大無毒濃度以下的雷公藤紅素，濃度分別設(shè)定為0.8μmol·L-1、0.08μmol·L-1、0.008μmol·L-1、0.0008μmol·L-1，作用24小時后取培養(yǎng)上清，分別應(yīng)用ELISA法和熒光定量PCR法測定HBsAg和HBV-DNA的水平。
　　 結(jié)

9、果:
　　 1)雷公藤紅素對原代肝細胞TC50為6.490±0.802μmol·L-1;當(dāng)濃度低于0.8μmol·L-1時對轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞沒有明顯毒性;
　　 2)在0.08μmol·L-1和0.8μmol·L-1雷公藤紅素組對HBsAg有顯著性抑制作用（P=0.000，P=0.000）;0.08μmol·L-1和0.8μmol·L-1雷公藤紅素組對HBV-DNA亦具有顯著性抑制作用（P=0.009，P=0.044

10、）;隨著雷公藤紅素濃度的增加，對HBsAg和HBV-DNA的抑制作用逐漸增強。
　　 結(jié)論:
　　 具有蛋白酶體抑制劑活性的天然化合物——雷公藤紅素不僅可以抑制HBV-DNA的復(fù)制，而且可以有效抑制HBsAg的表達。推測雷公藤紅素的抑制作用可能與雷公藤紅素對蛋白酶體的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。蛋白酶體抑制劑抑制了蛋白酶體的活性，使細胞中錯誤折疊的蛋白質(zhì)的降解受阻，干擾了細胞的各種新陳代謝過程，這種干擾效果累加起來導(dǎo)致這些細胞優(yōu)先進入

11、程序性的細胞死亡。
　　 第二部分EGCG聯(lián)合硼替佐米對轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞HBV的協(xié)同抑制作用
　　 背景:
　　 熱休克蛋白(Hsp)是一類ATP依賴的分子伴侶，在維持蛋白質(zhì)功能的完整性、穩(wěn)定新生蛋白質(zhì)并輔助其他蛋白正確的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運或降解等方面起到十分重要的作用。有研究證實熱休克蛋白60、熱休克蛋白70和熱休克蛋白90在乙型肝炎病毒復(fù)制和組裝等生命過程中扮演了重要的角色。EGCG[（-）epigallo

12、catechin-3-gallate，又稱表沒食子兒茶素沒食子酸酯]是綠茶中的主要成分，不僅是一種蛋白酶體抑制劑，而且可以抑制Hsp90的表達。較早的研究證實，EGCG不但具有明顯的清除體內(nèi)氧自由基、抗腫瘤、抗炎等多種生物學(xué)活性，而且在細胞和動物模型上均證實EGCG可以有效的抑制HBV復(fù)制，并可以降低血清中轉(zhuǎn)氨酶、減輕肝臟的病理損傷。
　　 EGCG作為一種Hsp90的抑制劑，通過干擾病毒復(fù)制的后期過程，如結(jié)構(gòu)蛋白的組裝、出芽、

13、蛋白的水解成熟以及傳染性子代病毒的釋放，從而調(diào)控、干擾或阻礙病毒蛋白的折疊，以此來干擾病毒多聚蛋白前體蛋白的蛋白水解過程，影響病毒蛋白酶的活性。通常情況下，這些缺乏折疊或未成熟的蛋白質(zhì)會被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)選擇性的降解，從而將其從細胞代謝中除去。但當(dāng)加入蛋白酶體抑制劑之后，抑制了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的生物學(xué)活性，使這些缺乏折疊的蛋白質(zhì)在細胞中積累，由此觸發(fā)了各種對細胞新陳代謝的影響和干擾。當(dāng)所有這些干擾效果疊加起來將導(dǎo)致有問題的細胞優(yōu)先進

14、入程序性的細胞死亡。
　　 目的:
　　 以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞為細胞模型，研究EGCG單獨作用時對HBV的抑制作用及機制。并同時探索了EGCG聯(lián)合蛋白酶體抑制劑硼替佐米對轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞HBV的協(xié)同抑制作用。
　　 方法
　　 1)采用新改良的兩步灌流法分離HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞，用percoll密度梯度離心法純化原代肝細胞，臺盼藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞密度為8×104·L-1，100μL/孔

15、，鋪于明膠包被的96孔板，進行原代培養(yǎng)24小時，加入不同濃度的EGCG，常規(guī)MTT法檢測不同濃度的EGCG對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞的細胞毒性;
　　 2)新分離的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞鋪于明膠包被的96孔板，原代培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，加入不同濃度的EGCG聯(lián)合1μmol·L-1硼替佐米，常規(guī)MTT法檢測不同濃度的EGCG聯(lián)合1μmol·L-1硼替佐米對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞的細胞毒性。
　　 3)新分離的

16、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞鋪于明膠包被的96孔板，設(shè)5個平行組，分別為:空白對照組、DMSO組、1μmol·L-1硼替佐米陽性藥物對照組、不同濃度（最大無毒濃度以下）的EGCG單藥組、不同濃度（最大無毒濃度以下）的EGCG聯(lián)合1μmol·L-1硼替佐米聯(lián)合組，作用24小時后取培養(yǎng)上清，分別采用ELISA法和熒光定量PCR法測定HBsAg和HBV-DNA的水平。
　　 4)新分離的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞鋪于6孔板，分別加入不同

17、濃度的并對HBV具有抑制作用濃度的EGCG，于不同時間下提取細胞蛋白，采用Western blot法檢測不同濃度EGCG、不同時間作用下HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞Hsp90的表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1)250μmol·L-1及以下濃度的EGCG對轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞均無毒性作用;250μmol·L-1及以下濃度EGCG聯(lián)合1μmol·L-1硼替佐米對細胞亦無明顯毒性作用;
　　 2)當(dāng)50μmol·L-1

18、和250μmol·L-1EGCG組單獨作用時，分別與對照組相比對HBsAg有顯著性的抑制作用(P=0.007，P=0.000);
　　 50μmol·L-1和250μmol·L-1EGCG組單獨作用時，分別與對照組比對HBV-DNA的抑制作用亦具有顯著性(P=0.019，P=0.008);
　　 3)50μmol·L-1的EGCG聯(lián)合1μmol·L-1硼替佐米時，與EGCG單藥組和硼替佐米單藥組相比，對HBsAg抑制作用

19、明顯均強于EGCG或者硼替佐米單藥作用(P=0.000, P=0.002);
　　 250μmol·L-1的EGCG聯(lián)合1μmol·L-1硼替佐米時，與EGCG單藥組和硼替佐米單藥組相比，對HBV-DNA的抑制作用明顯強于EGCG或者硼替佐米單藥作用(P=0.034，P=0.020);
　　 4) Western blot結(jié)果顯示:EGCG可以抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠原代肝細胞Hsp90的表達，并且抑制作用隨藥物濃度的增加和