應(yīng)用表觀遺傳學方法檢測母體循環(huán)中游離胎兒DNA.pdf

1、目的 探討應(yīng)用表觀遺傳學方法檢測孕婦血漿中胎兒游離DNA水平的應(yīng)用價值。檢測孕婦血漿中胎兒游離DNA的含量與非妊娠育齡婦女進行比較，有助于不依賴胎兒性別的表觀遺傳學標志進行產(chǎn)前診斷的研究；對不同孕期的孕婦血漿中胎兒游離DNA水平的比較則可能為非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷提供新的思路和資料，彌補遺傳基因標志物的不足，有利于向臨床的推廣應(yīng)用。 方法 隨機選擇60例經(jīng)產(chǎn)前檢查的健康孕婦，早期妊娠、中期妊娠及晚期妊娠各20例，妊娠的

2、診斷標準及分期標準參照第六版《婦產(chǎn)科學》<'[1]>。另選擇20例經(jīng)健康體檢確定為非妊娠的育齡婦女為對照組。用抗凝試管各抽取研究對象空腹外周血3ml，離心取血漿。用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取母體血漿中總的游離DNA。采用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測各組血漿標本中目的基因m-maspin(一種腫瘤抑制基因啟動子的甲基化序列)、u-maspin(前者的未甲基化序列，作為胎兒游離DNA的標志)及內(nèi)參照β-a

3、ctin基因的表達，讀取Ct值(cyclethreshold)。將妊娠組和對照組Ct值樣本均數(shù)進行統(tǒng)計學分析，若差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，再運用2<'-△△Ct>公式法進行相對定量，即妊娠各期的孕婦血漿中胎兒游離DNA相對的倍數(shù)。 結(jié)果 1.孕婦血漿中DNA的純度： 用QIAamp DNA Blood Mini Kit抽提的孕婦外周血漿中游離DNA，采用紫外分光光度計進行純度測定，絕大多數(shù)標本的DNA純

4、度較高，A260/A280比值在1.6～1.8之間。 2.普通PCR擴增內(nèi)參照基因β-actin和目的基因m-maspin、u-maspin的瓊脂糖電泳結(jié)果： β-actin的擴增產(chǎn)物為101bp，m-maspin和u-maspin的擴增產(chǎn)物為98bp，無引物二聚體，無雜帶，設(shè)計的PCR引物特異性好。 3.熒光定量PCR結(jié)果： 1)該檢測系統(tǒng)的特異性達100﹪，20例非妊娠婦女血漿中均未檢測到u-masp

5、in基因的表達；敏感性達95﹪，60例孕婦血漿中有57例可以檢測到胎兒游離DNA。 2)m-maspin在母體血漿中水平的檢測： 妊娠各組和對照組樣本均數(shù)進行兩樣本間的t檢驗，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。妊娠早、中、晚期及非妊娠的樣本均數(shù)間進行q檢驗，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可認為m-maspin在孕婦血漿中的DNA水平與正常非妊娠婦女無明顯差異，不是妊娠特異性的標志物。 3)u-maspin在

6、母體血漿中水平的檢測： u-maspin在正常非妊娠婦女血漿中未能檢測到，在孕婦血漿中的濃度隨妊娠進展表現(xiàn)出升高趨勢，妊娠早、中、晚期的樣本均數(shù)間進行q檢驗，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明u-maspin在母體血漿中的水平與妊娠有關(guān)，為妊娠特異性的標志物。 結(jié)論 孕婦血漿中存在胎兒游離DNA，晚期妊娠孕婦胎兒游離DNA水平明顯高于妊娠早、中期的正常孕婦。母體和胎兒來源的血漿游離DNA可通過胎盤組織特異性表達基