幾種海水魚類種質(zhì)超低溫冷凍保存研究.pdf

1、自20世紀(jì)50年代，Blaxter首次成功冰凍保存了太平洋鯡魚(Clupea harengus)精巢后，到目前為止，種質(zhì)資源的超低溫冷凍保存技術(shù)已經(jīng)取得了不錯(cuò)的成績，并正日益趨于成熟。目前，已對200多種淡水魚類、40多種海水魚類的精液作了冷凍保存研究，并獲得了成功保存，并建立了精子冷凍庫(cryobank)。但目前還尚未取得一個(gè)統(tǒng)一的方法適用于各種魚類，因此，魚類精液冷凍保存技術(shù)還有待需要進(jìn)一步的探索和推進(jìn)。同時(shí)期，魚類胚胎冷凍保存也

2、開始了相關(guān)研究。隨著生物技術(shù)和新型技術(shù)手段的不斷成熟和應(yīng)用，魚類胚胎冷凍保存研究的發(fā)展也取得了迅速的推進(jìn)。
　　星斑川鰈(Platichthys stellatus, Pallas1788)隸屬鰈形目(Pleuronectiformes)、鰈科(Pleuronectidae)、川鰈(Platichthys)屬。主要分布于白令海峽、楚科奇海、阿拉斯加和加拿大北部沿海以及北美和南加利福尼亞等，其中，在加拿大、美國、俄羅斯、中國、朝鮮、

3、韓國和日本等均有分布。但近些年，星斑川鰈的自然種群在我國已很少發(fā)現(xiàn)，并且星斑川鰈產(chǎn)精量少，限制了在人工繁育和雜交育種中的擴(kuò)大生產(chǎn)。
　　石斑魚為雌雄同體，暖水性海水魚類，以熱帶、亞熱帶分布居多，在我國主要分布于南海和東海。鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)和七帶石斑魚(Epinephelus septemfasciatus)隸屬鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑魚亞科(E

4、pinephelinae)、石斑魚屬(Epinephelus)。鞍帶石斑魚體型大、生長迅速，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的新型品種，但其雄魚數(shù)量少，產(chǎn)精量有限，這些因素的限制造成現(xiàn)實(shí)不能夠滿足實(shí)際的需求。此外，生殖隔離也阻隔了石斑魚種間雜交的發(fā)展。七帶石斑魚是在我國黃海唯一有分布的、具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的種類。本實(shí)驗(yàn)室于2013年已對七帶石斑魚精子進(jìn)行了冷凍保存，并獲得了成功。目前，由于七帶石斑魚因神經(jīng)壞死病的復(fù)發(fā)蔓延，該魚產(chǎn)量受到了嚴(yán)重影響。
　　

5、為此，鑒于以上幾種魚類所存在的問題，開展魚類種質(zhì)保存研究是解決和保持水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)魚類遺傳多樣性的一種可行性方法，并且該研究的開展已迫在眉睫，勢在必行。
　　本研究分別對星斑川鰈和鞍帶石斑魚兩種海水魚類的精子進(jìn)行了冷凍保存，在星斑川鰈精子冷凍保存研究中，主要對精子稀釋液(種類、成分、滲透壓)、激活海水適宜溫度，冷凍精液的適宜稀釋比例等方面進(jìn)行了篩選。研究得出，利用Ts-2和SFs-4作為稀釋液，10％DMSO為抗凍劑，

6、冷凍復(fù)蘇后用12℃海水激活能夠獲得較高的精子活力，并且利用稀釋20倍的凍精用于受精實(shí)驗(yàn)，能夠獲得較高的受精率。此外，運(yùn)用CASA系統(tǒng)對利用Ts-2和SFs-4冷凍保存的精子做了參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)利用SFs-4保存的精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)明顯高于Ts-2。
　　在鞍帶石斑魚精子冷凍保存研究中，主要對精子稀釋液種類、抗凍劑DMSO及 FBS適宜濃度作了篩選。結(jié)果得出，利用 ELS3和ELRS3作為稀釋液，15%DMSO和10%FBS作為抗凍劑，

7、精子的冷凍效果最好，解凍復(fù)蘇后精子活力最高。
　　同時(shí)，本研究對七帶石斑魚胚胎進(jìn)行了超低溫玻璃化冷凍保存，主要是從抗凍劑種類以及不同種類抗凍劑混合搭配使用對胚胎的毒性作用大小的角度，來篩選出毒性最低的最適宜的玻璃化液用于冷凍保存。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用35%PMG3+5%海藻糖(PMG3T)玻璃化液處理的未經(jīng)冷凍的胚胎的孵化率最高為31.76%，并經(jīng)冷凍保存后，發(fā)現(xiàn)78粒冷凍保存的卵中，解凍處理后有上浮卵6粒，并有1粒孵化出仔魚。

8、>　　此外，本研究還對利用PM、PMG3、PMG3T3玻璃化液處理和冷凍保存的七帶石斑魚肌節(jié)期胚胎內(nèi)的6種酶進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)鑒于玻璃化液處理和冷凍保存后的胚胎內(nèi)6種酶活性，除了MDA外，其他5種酶(SOD、CK、Na+/K+-ATPase、LDH、GSH-Px)活性均減少，表明冷凍和玻璃化液均使得胚胎細(xì)胞內(nèi)的抗氧化體系遭受損傷，造成胞內(nèi)能量代謝酶和某些抗氧化酶含量減少，脂質(zhì)過氧化損傷等，從而降低了冷凍胚胎復(fù)活率。通過對冷凍前后胚胎內(nèi)相關(guān)