人白細(xì)胞介素-21的基因克隆、表達(dá)及對(duì)NK92細(xì)胞生物學(xué)作用的初步研究.pdf

1、白細(xì)胞介素-21(IL-21)是2000年發(fā)現(xiàn)的由CD4+T細(xì)胞分泌的I型細(xì)胞因子。IL-21在其他細(xì)胞因子或刺激因子協(xié)同作用下能夠?qū)細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的生長(zhǎng)以及功能效應(yīng)發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用。成熟人IL-21相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)是15000，由131個(gè)氨基酸形成四螺旋束狀結(jié)構(gòu)域，與IL-2、IL-4和IL-15具有同源性。其生物學(xué)效應(yīng)是通過I型細(xì)胞因子受體IL-21R(IL-21Ra)介導(dǎo)的，但是必須與共用受體γ鏈(γc)結(jié)合才能介

2、導(dǎo)完整的生物學(xué)效應(yīng)。γc也是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15的共用受體。IL-2l主要來源于活化的CD4+T細(xì)胞。近期研究發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞可能是潛在分泌IL-21的重要細(xì)胞，通過分泌IL-21介導(dǎo)對(duì)B、T、NK細(xì)胞和自身的免疫調(diào)節(jié)。 IL-21Ra是一種新的白細(xì)胞介素受體(NILR)，它包含四個(gè)保守的半胱氨酸殘基，一段Trp-Ser-X-Trp-Ser基序，一段IL-2Rβ鏈高度保守的氨基酸序列。同IL-2、IL

3、-4、IL-7、IL-9和IL-15相似，IL-21活化JAK家族蛋白酪氨酸激酶JAK-1和JAK-3，其中JAK-1結(jié)合IL-21R亞單位，JAK-3結(jié)合于共同丫鏈。與其他γc家族細(xì)胞因子不同的是，這兩個(gè)激酶主要介導(dǎo)IL-21依賴的STAT1和STAT3的活化，而不是STAT5A和STAT5B的活化。IL-21R通常廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和一些骨髓細(xì)胞及角化細(xì)胞表面。 研究表明IL-21對(duì)NK、T及B等各種免疫細(xì)胞

4、介導(dǎo)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。IL-21對(duì)B細(xì)胞的發(fā)育或者增殖的影響并不明顯，不起主要作用，甚至引起B(yǎng)細(xì)胞凋亡，但研究表明IL-21能促進(jìn)B細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換、漿細(xì)胞的分化并在不同的微環(huán)境下對(duì)B細(xì)胞功能產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為功能的多態(tài)性。IL-21和IL-4都作為免疫球蛋白(Ig)的廣泛調(diào)解因子共同調(diào)節(jié)IgG和IgE的類別轉(zhuǎn)換及Ig的合成。IL-21和IL-15協(xié)同誘導(dǎo)naive(CD44low)和memory(CD44hi)CD8+T細(xì)胞的增殖，增

5、加產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T數(shù)量，誘導(dǎo)顆粒酶B基因的表達(dá)，這表明IL-21不僅能協(xié)同促進(jìn)T細(xì)胞的克隆增殖還能增強(qiáng)T細(xì)胞的功能效應(yīng)。IL-21單獨(dú)不能使NK細(xì)胞增殖或存活，甚至?xí)黾覰K細(xì)胞凋亡率。低劑量的IL-21能夠協(xié)同IL-2或IL-15促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，高劑量的IL-21卻抑制NK細(xì)胞的增殖，但這種抑制同時(shí)伴隨著向大顆粒淋巴細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生高水平的穿孔素和IFN-γ，增強(qiáng)NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性。考慮到IL-21對(duì)NK細(xì)胞功能的影

6、響時(shí)，往往離不開NK細(xì)胞表面受體方面的研究。NKG2D是NK細(xì)胞重要的活化性受體，曾有研究表明IL-21可以通過NKG2D機(jī)制增強(qiáng)腫瘤模型鼠的抗腫瘤效應(yīng)。但是也有文獻(xiàn)報(bào)道IL-21通過負(fù)調(diào)節(jié)接頭分子DAP10的基因表達(dá)而下調(diào)人primaryNK和CD8+T細(xì)胞表面NKG2D/DAP10的表達(dá)，從而抑制primaryNK細(xì)胞通過NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。這可能是由種屬差異造成的。 本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建含IL-21基因的原核表達(dá)載體，

7、優(yōu)化rhIL-21的表達(dá)條件；探索rhIL-21包涵體蛋白質(zhì)最佳復(fù)性條件；用Ni-NTA親和層析柱純化出高純度的rhIL-21，為大量生主rhIL-21及其生物學(xué)研究或臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上以NK92細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，通過對(duì)NK92細(xì)胞的增殖和殺傷功能的影響以及對(duì)表面活化性受體NKG2D的表達(dá)的分析，來初步探討IL-21對(duì)NK細(xì)胞的生物學(xué)作用。 方法和結(jié)果： 1.人IL-21基因的克隆和分析 根據(jù)Geneba

8、nk報(bào)告的人類IL-21基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)一對(duì)編碼人IL-21成熟肽的引物。上游包含NdeI酶切位點(diǎn)，下游含XhoI酶切位點(diǎn)。 以本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21為模板，用所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出IL-21目的基因。PCR片段用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠分離純化并與TA載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，平鋪于含100μg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)板上篩選陽性克隆。再通過PCR、雙酶切及測(cè)序方法對(duì)陽性克隆進(jìn)行鑒定，結(jié)果

9、表明成功構(gòu)建了pMD18-T-IL-21重組克隆載體，且無基因突變。 2.重組表達(dá)載體pET-30a(+)-IL-21的構(gòu)建及對(duì)rhIL-21表達(dá)條件的優(yōu)化 用NdeI和XhoI對(duì)pMD18-T-IL-21和載體pET-30a(+)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段和經(jīng)雙酶切后的pET-30a(+)，用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接復(fù)合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，平鋪于含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)板上篩選

10、陽性克隆。先通過對(duì)陽性克隆菌落進(jìn)行PCR分析，對(duì)PCR結(jié)果陽性的克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和基因測(cè)序鑒定。提取重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-IL-21，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21中，在含50μg/ml卡那霉素的LB板上得到單克隆工程菌BL21/pET-30a(+)-IL-21。 挑取單克隆接種于10ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)液，37℃活化培養(yǎng)。取活化后菌液接種到新的含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至A60

11、0nm=1.0～1.2時(shí)，以不同的接種比例接種于LB培養(yǎng)液形成不同起始誘導(dǎo)濃度梯度，然后觀察溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度對(duì)目的蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響。收集工程菌用SDS-PAGE和WesternBlot分析目的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果表明42℃是本工程菌發(fā)酵的最佳溫度，初始密度A600nm為0.2和0.4時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)量較高(分別為34％和32％)。 按上述發(fā)酵方法對(duì)表達(dá)菌株發(fā)酵培養(yǎng)，收集工程菌離心，超聲波破菌，再低溫高速離心，收取上清和

12、沉淀，用14％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明本工程菌表達(dá)的目的蛋白是以包涵體形式存在的。 3.包涵體的復(fù)性和目的蛋白質(zhì)的純化 收集誘導(dǎo)4h的工程菌菌液500ml，3000rpm×10min離心后用50mlBufferA重懸，用超聲波破菌儀破菌，200～300W，10min工作，10min間歇，全程20min。12,000g×30min離心，收集包涵體。用40mlBufferB洗滌包涵體沉淀，12，0

13、00g×30min離心獲得包涵體。包涵體用含8M尿素的20mlBufferC懸起置4℃冰箱8h以上，12,000g×30min離心，棄沉淀。溶解上清中加180mlbufferC稀釋包涵體濃度至0.2～0.3mg/ml。移至透析袋內(nèi)，依次于含0.01％SDS的500mlBufferD、500mlBufferE透析8小時(shí)以上，最后在不含有SDS的500mlBufferF中4℃透析8h以上，12,000g×30min離心，棄沉淀，得到復(fù)性后蛋

14、白質(zhì)。得到的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，并用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果表明本方法蛋白質(zhì)復(fù)性得率達(dá)到30％～35％。 根據(jù)Ni-NTASepharose操作說明純化6×Histag目的蛋白質(zhì)：吸取2ml50％的Ni-NTASepharose裝柱；把復(fù)性后上清液緩慢加入到Ni-NTA柱上；用1ml的washingbuffer洗柱4次；1mlelutionbuffer洗脫4次，分管收集，用SDS-PAGE分析

15、蛋白質(zhì)分布。結(jié)果表明在洗脫的第二管可以得到大部分目的蛋白質(zhì)，純度大于90％。純化的rhIL-21用0.22μm的微孔濾膜過濾，4℃保存。 4.rhIL-21的生物學(xué)活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NK92細(xì)胞，于96孔板中接種培養(yǎng)48h后，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)觀察不同濃度的rhIL-21對(duì)NK92細(xì)胞增殖的影響；同時(shí)用MTT法檢測(cè)rhIL-21刺激的NK92細(xì)胞對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果表明rhIL-21協(xié)同IL-2能夠促進(jìn)NK9

16、2細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)NK92細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。 結(jié)論： 1)成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-30a(+)-IL-21，建立了rhIL-21在大腸桿菌BL21中的最佳表達(dá)條件，rhIL-21表達(dá)量占菌體蛋白質(zhì)的32％～34％，目的蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在。 2)初步建立了包涵體復(fù)性策略，復(fù)性回收率可以達(dá)到30％～35％。用Ni-NTA親和層析柱純化可以得到純度＞90％的rhIL-21。 3)初步得到了具有生