異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑的神經(jīng)保護和促胚胎干細胞分化為神經(jīng)細胞的研究.pdf

1、淫羊藿(Herba EPimedii)是一味經(jīng)典的補益中藥，具有改善心腦血管系統(tǒng)功能、防治骨質(zhì)疏松、增強機體免疫力及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功效。其主要有效成分淫羊藿苷(icaritin，ICA)為異戊烯基黃酮苷類化合物，淫羊藿素(icaitin，ICT)和去甲淫羊藿素(desicaritin，DICT)是ICA的體內(nèi)代謝組分，也有少量存在于淫羊藿中。鑒于大豆黃素前體經(jīng)脫糖基去甲基后所形成的苷元呈現(xiàn)雌激素樣作用，本研究采用類似的結構修飾思路制備而得

2、ICT和DICT。采用MCF-7/BOS細胞增殖試驗(E-SCREEN法)檢測此三個化合物是否具有雌激素樣活性并對相關機制進行探索，在此基礎上論文第二章拓寬了對異戊烯基黃酮類結構類似物的雌激素樣活性構效關系研究。 鑒于許多難治性復雜疾病如神經(jīng)退行性改變等均與體內(nèi)雌激素水平的異常相關，而雌二醇具有神經(jīng)保護作用并在神經(jīng)發(fā)育分化中發(fā)揮重要作用。本論文進一步探討了異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑在神經(jīng)保護和神經(jīng)分化方面的可能活性和機制，旨

3、在為此類植物來源的雌激素受體調(diào)節(jié)劑防治神經(jīng)退行性改變的活性提供依據(jù)。 第一章淫羊藿素及去甲淫羊藿素的雌激素樣活性及機制研究為評價lCA、ICT和DICT的雌激素樣活性并對機制進行探索，本研究采用E-SCREEN法和雌激素受體效應基因檢測法相結合進行活性評價。實驗采用MTT法檢測細胞數(shù)量，流式細胞術分析細胞周期變化，RT-PCR法檢測雌激素受體效應基因表達變化，并運用雌激素受體拮抗劑ICI 182,780作為工具藥對雌激素受體依賴

4、性進行評價。 第二章異戊烯基黃酮類衍生物雌激素樣活性構效關系研究及機制探討基于ICA、ICT和DIGT由于取代基團不同帶來的雌激素活性差異，本研究對系列異戊烯基結構類似物進行了進一步考察，采用生物活性評價和計算機輔助受體一配體對接實驗(DOCKING)相結合的方法對異戊烯基黃酮類化合物的雌激素樣活性構效關系進行了初步探索。 第三章異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑淫羊藿素對Aβ肽所致大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷的保護作用近年來，雌

5、激素在防治神經(jīng)退行性改變中的作用受到極大關注，但對其治療地位和作用機理尚存在較大爭議，雌激素對阿爾茨海默病(AIzheimer’s Disease，AD)的治療地位與價值也遠未闡明亟待獲得肯定。鑒于雌二醇對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用，本研究對異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑在AD防治中的潛在價值及其機制進行了初步探索。由于淀粉樣蛋白所致神經(jīng)損傷是AD的重要病理基礎之一，Aβ25-35則是β淀粉樣蛋白的毒性片斷，本實驗采用Aβ25-35致原代培養(yǎng)大

6、鼠胚胎神經(jīng)細胞毒性損傷模型，用以評價異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑的神經(jīng)保護作用并對機制進行研究。實驗采用免疫熒光法鑒定原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞，倒置顯微鏡觀察評價細胞形態(tài)學變化，MTT法和乳酸脫氫酶(LDH)釋放量檢測評價細胞生存狀況，AO／EB染色用于初步評價細胞凋亡情況，JC-1染色法評價細胞膜電位的變化，WesternBlot法檢測相關蛋白表達變化。結果表明，ICT能夠濃度依賴性地抵抗Aβ25-35所致的神經(jīng)細胞毒性損傷，表現(xiàn)為細胞生存

7、率升高，培養(yǎng)基中LDH釋放減少，神經(jīng)元染色質(zhì)固縮減少。該過程與神經(jīng)細胞線粒體跨膜電位(△ψm)改變及Bcl-2家族蛋白表達變化有關。ICT能抵抗Aβ25-35所致神經(jīng)細胞Aψm損失，上調(diào)抗凋亡蛋白Bc1-2的表達，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。該活性能被雌激素受體拮抗劑ICI182，780部分拮抗，表明該作用是雌激素受體依賴性的；ERK-MAPK抑制劑PD98059也能部分拮抗ICT的神經(jīng)保護作用，表明ERK-MAPK通路也參與了該神經(jīng)保護過程

8、。 第四章異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑淫羊藿素對小鼠胚胎干細胞分化為神經(jīng)細胞的誘導作用AD是以神經(jīng)元損傷丟失為特征的難治性神經(jīng)退行性疾病，細胞移植治療是未來的治療前景之一。目前，胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)體外定向分化為神經(jīng)細胞的潛能用于退行性改變的細胞替代治療，及藥物介入細胞替代治療的前景已引起關注。主要研究進展集中在簡化誘導步驟，縮短誘導時間及控制神經(jīng)細胞發(fā)生途徑接近體內(nèi)神經(jīng)細胞發(fā)生過程

9、等方面。與此同時，部分研究表明，某些小分子藥物可通過調(diào)節(jié)ES細胞微環(huán)境控制其分化命運，為ES細胞的定向分化開辟了新思路。 上述研究結果提示，ICT可經(jīng)由雌激素受體和ERK-MAPK通路保護原代培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)細胞免受損傷，提示發(fā)育中神經(jīng)細胞可能存在ICT作用環(huán)節(jié)。而且有研究表明，某些小分子藥物可通過調(diào)節(jié)ES細胞微環(huán)境控制其分化命運。本實驗利用小鼠ES細胞體外定向分化為神經(jīng)細胞的模型，旨在探索異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑對ES細胞分

10、化神經(jīng)細胞潛在的促進作用，并對分化過程中的生物信息變化和分化機制作初步研究。實驗采用維甲酸(Retinoicacid，RA)作為陽性藥，采用4-4+擬胚體分化法構建ES細胞分化模型，用細胞形態(tài)學觀察和免疫細胞化學標記的方法評價ES細胞分化為神經(jīng)細胞過程中的形態(tài)學變化，用流式細胞儀檢測藥物誘導下神經(jīng)前體細胞標志蛋nestin和神經(jīng)元標志蛋白B-TublinIII陽性表達細胞情況，采用RT-PCR和Westem Blot法檢測ES細胞分化過

11、程中基因和蛋白表達的變化。結果顯示ICT(0.01-1 μmol/L)和RA(0.1μmol/L)能促進ES細胞分化為神經(jīng)細胞，顯著增加ES細胞分化而來的前體細胞(d 9+0)和成熟神經(jīng)元細胞(d 8+10)數(shù)量。RT-PCR法檢測發(fā)育標志基因結果顯示，ICT和RA能增加ES細胞發(fā)育過程中中胚層和外胚層發(fā)育基因Fgf、Branchy的表達，并延長表達時相。Westem Blot結果顯示，神經(jīng)標志蛋白B-Tublin III和膽堿能神經(jīng)標

12、志蛋白(膽堿乙酰基轉移酶，ChAT)在分化后期(d8+0開始)表達不斷增加。d 8+5和d 8+10，RA和ICT處理組β-TublinIII、ChAT蛋白表達顯著增加，提示RA和ICT具有促進ES細胞分化為神經(jīng)細胞的作用，并且分化的細胞中包含膽堿能神經(jīng)。分化機制初步探索結果顯示，ICT組和RA組p38磷酸化水平較溶劑對照組低，而ERK磷酸化水平略為偏高。鑒于p38在ES細胞定向分化過程的分子開關作用，本實驗結果提示ICT可能是通過抑制

13、p38蛋白磷酸化的途徑促進ES細胞分化為神經(jīng)細胞。為論證異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑上述促分化共性作用，進一步對IBA進行了促定向分化作用檢測。結果顯示，其促ES細胞定向分化神經(jīng)細胞作用與lCT相近似，而ICA則無明顯的活性，表明具有雌激素樣活性的異戊烯基黃酮可能具有此類促分化共性作用，該活性與雌激素受體調(diào)節(jié)作用呈相關性。第五章生物活性導向法分離中藥補骨脂中異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑前述實驗表明，IBA具有較強的雌激素樣活性。鑒于

14、ICT來源于補益中藥淫羊藿，IBA也是補益中藥補骨脂的化學成分之一，本研究采用E-SCREEN生物活性導向法分離補骨脂的異戊烯基黃酮類雌激素樣活性組分，旨在為進一步作構效關系研究提供化合物來源。 本研究采用醇提法獲取補骨脂藥材粗提品，以液液萃取、柱層析分離、HPLC分析、LC-MS、NMR結構解析為主要方法，以E-SCREEN法評價各層次組分雌激素樣活性(生物活性導向)進行逐步分離。最終得4個雌激素活性化合物，其中三個為異戊烯基

15、黃酮類化合物，分別為異補骨脂查爾酮(isobavachalcone)、新異補骨脂黃酮(neobavaisoflavone)和8-異戊烯基大豆素(8-prenyldaidzein)。本研究工作為補益中藥藥效物質(zhì)基礎后續(xù)研究提供了重要線索。結論1、ICT、DICT和IBA等異戊烯基黃酮類化合物具有雌激素樣作用，該作用經(jīng)由雌激素受體介導，通過調(diào)控雌激素受體效應基因蛋白表達和調(diào)節(jié)細胞周期發(fā)揮作用，是一類新型結構的植物來源雌激素受體調(diào)節(jié)劑。

16、 2、異戊烯基黃酮類雌激素受體調(diào)節(jié)劑構效關系具有以下特點：異戊烯基是此類化合物的重要共性特征之一；取代基位置和疏水性強弱可影響其內(nèi)在活性；與雌激素受體的親和力大小是影響其活性強弱的主要因素之一，分子中糖基取代可影響受體一配體親和力而使其喪失活性。 3、ICT具有抗Aβ25-35所致原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞損傷的作用，該作用能被雌激素受體拮抗劑ICI 182,780和ERK．MAPK激酶抑制劑PD 98059部分阻斷。表明該保護作用是通

17、過雌激素受體介導，并與ICT上調(diào)Bc1-2蛋白，阻斷線粒體凋亡通路有關。 4、ICT和IBA具有誘導小鼠ES細胞體外定向分化為神經(jīng)細胞(含ChAT陽性表達細胞)的作用，是一類有前景的分化誘導劑；該類異戊烯基黃酮雌激素受體調(diào)節(jié)劑的促分化作用與雌激素樣活性有關，但并不完全通過ER依賴性途徑發(fā)揮作用，ICT引起的p38低磷酸化水平可能是此類化合物促分化的重要因素。 5、同屬補益中藥的淫羊藿與補骨脂中，含有多種具有雌激素樣作用異