Periostin對牙周膜干細胞定向分化為神經(jīng)細胞作用的影響.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)的構(gòu)建在生理性牙周膜重建的過程中是不可或缺的重要環(huán)節(jié)，對于維持牙周膜的完整性以及牙周膜功能的行使具有一定意義。因此，牙周膜內(nèi)神經(jīng)的重建對于種植體周圍生理性牙周膜的構(gòu)建有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜干細胞有向神經(jīng)細胞分化的潛能，為生理性牙周膜的重建提供了重要的理論依據(jù)。因此，如何有效地促進牙周膜干細胞分化為神經(jīng)細胞是本課題的核心內(nèi)容。
　　實驗目的：
　　擬通過研究Periostin對牙周膜干細胞(

2、hPDLSCs)定向分化為神經(jīng)細胞的作用及調(diào)控機制，進而探索重建生理性牙周膜的可能，為種植體周圍生理性牙周膜的構(gòu)建提供重要理論依據(jù)。
　　實驗方法：
　　第一部分:人牙周膜干細胞的培養(yǎng)及誘導分化
　　1.1人牙周膜干細胞(hPDLSCs)的誘導培養(yǎng)
　　對照組:將hPDLSCs接種于六孔板，加入bFGF預誘導液，誘導液中bFGF的濃度為10ng/mL，在誘導24 h后換液，用PBS輕輕洗滌三次后再加入誘導液，繼續(xù)

3、進行誘導培養(yǎng)，隔天換液并拍照。
　　實驗組:加入誘導液同時添加100 ng/mL的Periostin外源性刺激的牙周膜干細胞繼續(xù)誘導培養(yǎng)，隔天換液并拍照。
　　1.2 Western blot、免疫熒光檢測牙周膜干細胞成神經(jīng)相關(guān)蛋白(β-tubulinⅢ、GFAP、NSE)的表達。
　　第二部分:沉默牙周膜干細胞Periostin的表達對hPDLSCs定向分化為神經(jīng)細胞的影響
　　2.1構(gòu)建Periostin基因

4、干擾慢病毒，RT-PCR法檢測慢病毒LVX-PERIOSTIN-RNAi下調(diào)PERIOSTIN基因表達效率
　　2.2 Periostin基因的干擾慢病毒感染hPDLSCs細胞，WB、免疫熒光檢測牙周膜干細胞成神經(jīng)相關(guān)蛋白（β-tubulinⅢ、GFAP、NSE）的表達。
　　實驗結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)的hPDLSCs細胞呈現(xiàn)多角形、不規(guī)則或者是梭型。經(jīng)過Periostin刺激誘導分化后，細胞逐漸變?yōu)殚L梭形，呈現(xiàn)出神經(jīng)細

5、胞的特征性形態(tài)。
　　2.WB及免疫熒光染色顯示，在hPDLSCs細胞中，β-tubulinⅢ、GFAP、NSE均呈低表達，而經(jīng)成神經(jīng)誘導培養(yǎng)后，其β-tubulinⅢ、GFAP、NSE表達水平顯著升高，在此基礎(chǔ)上，使用外源性Periostin刺激后，β-tubulinⅢ、GFAP、NSE表達水平進一步升高。WB結(jié)果顯示，在培養(yǎng)第4天時，β-tubulinⅢ、GFAP、NSE表達水平達到一個相對的高峰，在誘導培養(yǎng)第7天時，β-tu

6、bulinⅢ、GFAP、NSE表達水平較第4天時有所下降。
　　3.我們成功構(gòu)建了LVX-PERIOSTIN-RNAi，并使用其感染hPDLSCs細胞。進一步采用western blot、免疫熒光法檢測了LVX-PERIOSTIN-RNAi感染后神經(jīng)細胞特異性相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示，在感染空載體后，外源性Periostin能夠顯著上調(diào)神經(jīng)細胞特異性相關(guān)蛋白β-tubulinⅢ、GFAP、NSE的表達。而在感染LVX-PERIOS