人TNFR1-PLAD及其突變體基因克隆與表達純化及其生物學活性鑒定.pdf

1、TNFR1胞外段含有四個半胱氨酸富集區(qū)(CDR)區(qū),在與TNF-α結(jié)合前首先通過CDR1區(qū)形成三聚體,所以CDR1區(qū)又稱為PLAD(pre-ligand assembly domain)。本課題組前期研究采用噬菌體展示技術(shù)分別用sTNF-a和TNFR1為誘餌篩選到12AA的“TNF結(jié)合肽”和“TNFR封閉肽”,體內(nèi)、體外實驗均證實兩種肽都對TNF-a介導(dǎo)的生物學效應(yīng)有較好的抑制作用。但由于短肽自身半衰期較短,極易通過腎小球濾過,無法充分

2、發(fā)揮應(yīng)有的藥效。因此,本實驗利用分子克隆技術(shù)及蛋白純化技術(shù)獲得PLAD三聚體化所需的關(guān)鍵肽段,試圖將該片段分別連接到“TNF結(jié)合肽”和/或“TNFR封閉肽”末端,使之通過TNFR1-PLAD的自身三聚化作用而聚合為三聚體,延長兩種肽在體內(nèi)的的半衰期,為進一步研發(fā)抗TNF-α藥物奠定基礎(chǔ)。
　　隨著人們生活水平日益提高,肥胖也變得越來越普遍,全球范圍內(nèi)超重的人群數(shù)量多于體重不足的人群數(shù)量。隨著肥胖的流行,肥胖相關(guān)的一些疾病的發(fā)病率如

3、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝和II型糖尿病等也不斷增加,而胰島素抵抗是這些疾病發(fā)病機制中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié),但其細胞水平的機制尚不完全清楚。腫瘤壞死因子-a(TNF-a)作為脂肪組織分泌的脂肪細胞因子,它參與調(diào)節(jié)食欲、胰島素敏感性以及炎癥反應(yīng)等各種生理和病理過程。TNF-a又分跨膜型(tmTNF-a)和分泌型(sTNF-a),tmTNF-a、sTNF-a都可以與TNFR相互作用,但引起的生物學功能并不相同。我們實驗室前期工作表明:tmTNF-

4、α可殺傷對sTNF-α耐受的腫瘤細胞株,sTNF-α主要誘導(dǎo)細胞壞死,而tmTNF-α則主要誘導(dǎo)凋亡,因此推測tmTNF-a在胰島素抵抗中可能發(fā)揮的作用與sTNF-a也不相同。本文成功構(gòu)建表達野生型TNF--a(即可表達sTNF-a,也可表達tmTNF-a)的TNFpIRES2-GFP-wtTNF質(zhì)粒、只表達tmTNF-a的pIRES2-GFP-tmTNF-a的質(zhì)粒和只表達sTNF-a的pIRES2-GFP-sTNF-a質(zhì)粒,并將其穩(wěn)定