糞便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因甲化化分析對結(jié)直腸癌篩查、早期診斷的價值.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見的消化道惡性腫瘤。早期結(jié)直腸癌患者經(jīng)治療后5年生存率可達90％以上，但往往早期結(jié)直腸癌患者很少有臨床癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)。而晚期結(jié)直腸癌患者的5年生存率不足10％。因此，尋找一個有效的易于篩查及早期診斷結(jié)直腸癌的試驗方法，對結(jié)直腸癌的治療甚至治愈有很重要的意義。目前常用的結(jié)直腸癌篩查、診斷方法，如糞便隱血試驗(Fecal Occult Blood Testing，F(xiàn)OBT)及結(jié)直

2、腸鏡檢查等存在特異性、敏感性或患者依從性的不足，限制了其在結(jié)直腸癌篩查及早期診斷中的廣泛應(yīng)用。由于糞便脫落細胞在糞便中的持續(xù)、穩(wěn)定存在性，2009年《美國胃腸病學會結(jié)直腸癌篩查指南》已經(jīng)明確將檢測糞便DNA甲基化情況作為推薦篩查方法。
　　Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因(Ras association domain family1A，RASSF1A)是一種抑癌基因。目前研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中檢測到RASSF1A基因異常甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉

3、默，尤其是在結(jié)直腸癌中，有研究發(fā)現(xiàn)其甲基化率可高達81％。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(Runt related transcription factor3，RUNX3)亦為腫瘤抑制基因，其編碼的RUNX3蛋白是TGF-β信號傳導(dǎo)通路下游中一個非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，對細胞的分化、細胞周期調(diào)控、凋亡起負性調(diào)節(jié)作用。RUNX3基因的甲基化或等位缺失可致其表達異?！，F(xiàn)在諸多研究證明，RUNX3表達和消化道惡性腫瘤相關(guān)。hMLH1基因是錯配修復(fù)基因中最

4、重要的一種。在腫瘤細胞中，hMLH1基因功能的失活可能是由于其啟動子區(qū)CpG島被高度甲基化，而使得hMLH1基因不能表達。Kuismanenu等在研究36例散發(fā)性MSI結(jié)直腸癌中，發(fā)現(xiàn)30例(92％)發(fā)生了hMLH1的高甲基化?？梢奾MLH1甲基化在散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生中起重要作用。
　　目的:
　　應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylated-specific PCR，MSP)法聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸非腺瘤性

5、息肉、正常對照組糞便及組織DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化情況，探討其對結(jié)直腸癌篩查、早期診斷的價值及與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法:
　　1、收集2013年1月至2013年10月期間在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院和第四醫(yī)院就診或住院的56例結(jié)直腸癌、27例結(jié)直腸腺瘤、32例結(jié)直腸非腺瘤性息肉患者及30例內(nèi)鏡檢查未見異常者的糞便標本及組織標本，記錄臨床及病理資料。
　　2、使用糞便基因組

6、DNA提取試劑盒提取糞便DNA及酚-氯仿抽提法提取組織DNA，選取符合標準的DNA后應(yīng)用MSP法聯(lián)合檢測RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化情況。
　　結(jié)果:
　　1、糞便DNA甲基化分析結(jié)果
　　共提取糞便樣本147例，最終擴增出人β-actin基因片段的共145例，其中結(jié)直腸癌組、結(jié)直腸腺瘤組、結(jié)直腸非腺瘤性息肉組和正常對照組分別為56例，27例，32例和30例。結(jié)直腸癌患者糞便DNA中RASSF

7、1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化率為53.57％、58.93％、50.00％，91.07％的結(jié)直腸癌患者糞便中至少可以檢測到有一個基因甲基化，特異性75.28％;結(jié)直腸腺瘤患者糞便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化率為33.33％、37.04％、25.93％，66.67％的結(jié)直腸腺瘤患者糞便中至少可以檢測到有一個基因甲基化;其中進展型腺瘤患者糞便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟

8、動子甲基化率為38.89％、44.44％、33.33％，77.78％的進展型腺瘤患者糞便中至少可以檢測到有一個基因甲基化;非腺瘤性息肉患者糞便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化率為9.38％、9.38％、6.25％，9.38％的非腺瘤性息肉患者糞便中至少可以檢測到有一個基因甲基化;正常對照組糞便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化率為0％、3.33％、0％，在正常對照組中檢測到1例R

9、UNX3基因甲基化。擴增成功的145例糞便標本進行FOBT檢測，共有18例檢測結(jié)果陽性，其中結(jié)直腸癌組17例（陽性率30.36％），進展型腺瘤組1例（陽性率3.70％），與聯(lián)合檢測糞便DNA甲基化相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　結(jié)直腸癌患者糞便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化情況在腫瘤大小、浸潤深度之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在其他臨床資料之間（除RUNX3與分化程度之間差

10、異有統(tǒng)計學意義）差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)直腸腺瘤患者糞便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化程度在腺瘤的大小、伴上皮內(nèi)瘤變級別(RUNX3除外)之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在組織類型之間差異無統(tǒng)計學意義。
　　檢測糞便DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因甲基化對于早期結(jié)直腸癌和進展型腺瘤的發(fā)現(xiàn)率分別為42.86％、57.14％、42.86％，特異性為95.16％、93.55

11、％、96.77％，聯(lián)合檢測3個基因甲基化對早期結(jié)直腸癌和進展型的發(fā)現(xiàn)率為80.36％，特異性為93.55％，陽性預(yù)測值為91.84％，陰性預(yù)測值為84.58％。
　　2、組織DNA甲基化分析結(jié)果
　　共有145例組織DNA樣本進行MSP。結(jié)直腸癌組織DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化率為55.36％、60.71％、51.79％，92.86％的結(jié)直腸癌組織中至少可以檢測到有一個基因甲基化，特異性69

12、.66％;結(jié)直腸腺瘤組織DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化率為40.74％、44.44％、33.33％，70.37％的結(jié)直腸腺瘤組織中至少可以檢測到有一個基因甲基化;其中進展型腺瘤組織DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化率為50.00％、55.56％、38.89％，83.33％的進展型腺瘤組織中至少可以檢測到有一個基因甲基化;非腺瘤性息肉組織DNA中RASSF1A、RUNX3、hML

13、H1基因啟動子甲基化率為12.50％、25.00％、6.25％，25.00％的非腺瘤性息肉組織中至少可以檢測到有一個基因甲基化;正常對照組織DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化率均為0％。
　　結(jié)直腸癌患者組織DNA中RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因啟動子甲基化情況在腫瘤大小、浸潤深度（組織中RUNX3除外）之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在其他臨床資料之間（除RUNX3與分化程度之間差異

14、有統(tǒng)計學意義）差異無統(tǒng)計學意義。
　　3、糞便DNA中基因甲基化與組織DNA中基因甲基化情況的比較
　　RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因甲基化在結(jié)直腸癌組織和糞便之間、結(jié)直腸腺瘤組織和糞便之間，差異均無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1、RASSF1A、RUNX3、hMLH1基因的甲基化率在正常對照、結(jié)直腸非腺瘤性息肉、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌中呈逐漸增高的趨勢。
　　2、RASSF1A、RUNX3、h