結(jié)直腸癌Tiam1基因異常甲基化的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類的健康。和其他腫瘤一樣，其病因迄今尚未明確。近二十年來(lái)，由于我國(guó)人民飲食及生活習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率增長(zhǎng)顯著。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。因此，積極開(kāi)展結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究對(duì)于結(jié)直腸癌的診治具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。 結(jié)直腸癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是病人死亡的主要原因。因此，深入開(kāi)展結(jié)直腸癌Tiam1表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，將有助于進(jìn)一步明確Tiam1在結(jié)直腸癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程

2、中的作用，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供切入點(diǎn)。 現(xiàn)代腫瘤學(xué)認(rèn)為，基因的突變、缺失等經(jīng)典遺傳學(xué)改變與基因的表觀遺傳異常共同作用導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。表觀遺傳是指在基因的DNA序列沒(méi)有發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)發(fā)生了可遺傳的信息變化，并最終導(dǎo)致了表型的改變。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中非常重要的基因調(diào)控機(jī)制，目前對(duì)其的研究也最為深入。眾多研究表明，幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中都存在著DNA甲基化譜的紊亂。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中普遍存在著基因組DN

3、A整體低甲基化和局部區(qū)域高甲基化的特點(diǎn)?；蚪M內(nèi)過(guò)低的甲基化會(huì)導(dǎo)致整個(gè)基因組的不穩(wěn)定性增加，并能夠使一些在正常情況下受到抑制的基因，如癌基因或相關(guān)因子得到大量表達(dá)，而啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的過(guò)度甲基化導(dǎo)致抑制基因的表達(dá)下調(diào)或失活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。 與經(jīng)典遺傳學(xué)改變不同的是，表觀遺傳學(xué)是一個(gè)可逆的化學(xué)修飾過(guò)程，因此可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。例如，使用去甲基化藥物5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidin

4、e，5-aza-dC）抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase1，DNMT1）的活性，使因甲基化而表達(dá)抑制的基因恢復(fù)表達(dá)，或者使用甲基化藥物S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-1-methionine，SAM）抑制DNA的脫甲基作用，使因低甲基化而表達(dá)增高的基因受到抑制，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型。 本課題的目的是研究表觀遺傳學(xué)在結(jié)直腸癌Tiam1基因表達(dá)中的作用，重點(diǎn)闡明5’端CpG島異常甲基化對(duì)

5、Tiam1基因表達(dá)調(diào)控的影響。 方法: 1.116例配對(duì)結(jié)直腸癌組織中Tiam1蛋白的表達(dá)及臨床意義 應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法，檢測(cè)116例結(jié)直腸癌和配對(duì)的正常結(jié)直腸黏膜以及其中部分的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中Tiam1蛋白的表達(dá)與分布，并分析其與臨床病理資料之間的關(guān)系。 2.116例配對(duì)結(jié)直腸癌組織中Tiam1基因的甲基化情況及臨床意義 應(yīng)用甲基化特異性PCR（Methylation Specifi

6、c PCR，MSP），檢測(cè)116例結(jié)直腸癌和配對(duì)的正常結(jié)直腸黏膜組織中Tiam1基因的甲基化情況。并分析其與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系及其臨床意義。 3.結(jié)直腸癌細(xì)胞株中DNA甲基化調(diào)控Tiam1基因表達(dá)的作用研究及SAM對(duì)于部分結(jié)直腸癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響 四種結(jié)直腸癌細(xì)胞株（HT29、LS-174T、SW620、LoVo）經(jīng)去甲基化藥物5-aza-dC或甲基化藥物SAM處理后，應(yīng)用RT-PCR、免疫印記、免疫細(xì)胞化學(xué)、MS

7、P方法觀察其Tiam1 mRNA和蛋白的表達(dá)及其DNA甲基化情況的改變。SAM處理LoVo、SW620兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞株后，應(yīng)用MTT、平板克隆、遷移實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)觀察在過(guò)甲基化狀態(tài)下結(jié)直腸癌細(xì)胞株的生物學(xué)行為變化。 結(jié)果: 1.配對(duì)結(jié)直腸癌組織中Tiam1蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示Tiam1在配對(duì)的正常結(jié)直腸黏膜、癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌三種類型的組織中表達(dá)明顯不同。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，在配對(duì)的正常黏膜組織和腫瘤組織中，

8、Tiam1蛋白的表達(dá)前者明顯低于后者，差異具有顯著性（Z=-4.608，P=0.000）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織Tiam1表達(dá)要比配對(duì)的結(jié)直腸原發(fā)癌組織強(qiáng)（Z=-3.115，P=0.002）；伴發(fā)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織比未發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌組織Tiam1表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異具有顯著性（Z=-2.584，P=0.01）。本研究結(jié)果提示，Tiam1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，即Tiam1表達(dá)弱或陰性者轉(zhuǎn)移的發(fā)生率低，表達(dá)強(qiáng)者其轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。此外，我們

9、的研究還發(fā)現(xiàn)，Tiam1的表達(dá)與腫瘤的分化顯著相關(guān)，結(jié)直腸低分化癌中Tiam1的表達(dá)要低于高-中分化腺癌，差異具有顯著性（Z=-2.673，P=0.008）。 2.116例配對(duì)結(jié)直腸癌組織中Tiam1基因的甲基化情況及臨床意義 采用MSP法檢測(cè)了116例結(jié)直腸癌組織及配對(duì)的正常粘膜中Tiam1基因的甲基化情況，并結(jié)合其表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果提示結(jié)直腸癌組織Tiam1的甲基化率低于配對(duì)的正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.

10、244； P=0.025）；經(jīng)相關(guān)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Tiam1基因的甲基化情況與其表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)性（r=-0.494，P=0.000）。 經(jīng)X2檢驗(yàn)，Tiam1基因的甲基化情況與患者的年齡和腫瘤的分化程度相關(guān)（P<0.05）。也就是說(shuō)在年齡低的患者中Tiam1基因的甲基化率要高于年齡高的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=4.838 P=0.028）；在低分化的腫瘤組織中Tiam1基因的甲基化率要高于高-中分化的腫瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義（X2=17.848P=0.000）。 3.結(jié)直腸癌細(xì)胞株中甲基化調(diào)控Tiam1基因表達(dá)的作用研究及SAM對(duì)于部分結(jié)直腸癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證DNA甲基化與結(jié)直腸癌Tiam1基因表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系，我們用去甲基化藥物5-aza-dC處理結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29和LS174T，并用甲基化藥物SAM處理結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620和LoVo，分別采用RT-PCR、免疫印記、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)藥物處理前后結(jié)

12、直腸癌細(xì)胞中Tiam1 mRNA和蛋白表達(dá)，MSP法檢測(cè)Tiam1基因甲基化狀態(tài)的改變。 結(jié)果顯示，5-aza-dC處理后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中Tiam1 mRNA和蛋白均恢復(fù)表達(dá)或顯著增強(qiáng)，MSP法檢測(cè)證實(shí)該基因發(fā)生了去甲基化改變；SAM處理后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中Tiam1 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低，同樣，MSP法檢測(cè)證實(shí)該基因發(fā)生了甲基化改變。提示Tiam1在這些結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)的改變是該基因甲基化狀態(tài)改變的直接作用，表明DN

13、A異常甲基化是結(jié)直腸癌Tiam1表達(dá)改變的直接調(diào)控機(jī)制。 MTT法繪制細(xì)胞的體外生長(zhǎng)曲線，經(jīng)析因方差分析，不同處理組細(xì)胞差異具有顯著性（LoVo：F=705.056，P=0.000；SW620：F=489.138，P=0.000）；不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響差異具有顯著性（LoVo：F=646.360，P=0.000；SW620：F=1627.063，P=0.000）；各組細(xì)胞與各時(shí)間組兩因素交互效應(yīng)顯著（LoVo：F=4

14、2.223，P=0.000； SW620：F=40.435，P=0.000）；除第1天外，其他各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞組間的細(xì)胞增殖差異具有顯著性。經(jīng)LSD法多重比較，結(jié)果表明，與未處理組和S-腺苷高半胱氨酸（S-Adenosyl-L-homocysteine，SAH）處理組細(xì)胞相比，兩種經(jīng)SAM處理的細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，而未處理組和SAH處理組細(xì)胞的增殖速度無(wú)顯著差異。 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)SAM處理的兩種細(xì)胞的克隆形成能力均明顯

15、減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LoVo：F=40.634，P=0.000； SW620：F=88.605，P=0.000）。 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，SAM處理組結(jié)直腸癌細(xì)胞與對(duì)照組比較，LoVo細(xì)胞發(fā)生了S期阻滯，差異具有顯著性（F=106.826，P=0.000）；而SW620細(xì)胞發(fā)生了G1期阻滯，差異具有顯著性（F=166.932，P=0.000）。 運(yùn)動(dòng)小室實(shí)驗(yàn)證明，與未處理組和SAH處理組細(xì)胞相比經(jīng)SAM處理的兩株細(xì)胞

16、的運(yùn)動(dòng)能力均減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LoVo：F=25.855，P=0.000；SW620：F=36.358，P=0.000）。 結(jié)論: 1.Tiam1基因在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，在局部轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中表達(dá)明顯增強(qiáng)。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Tiam1基因與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是一種結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因； 2.在結(jié)直腸癌中，Tiam1基因的5’端CpG島甲基化水平降低，并且與該基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明DN