NLRP3炎癥體在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和功能的初步研究.pdf

1、炎癥體(inflammasomes)是存在于細(xì)胞內(nèi)的一類多蛋白復(fù)合物,作為機(jī)體對(duì)內(nèi)外源危險(xiǎn)信號(hào)的應(yīng)答平臺(tái),通過促進(jìn)IL-18和 IL-1β等效應(yīng)細(xì)胞因子活化,或通過誘導(dǎo)細(xì)胞pyroptosis(一種程序化、炎性的細(xì)胞死亡方式),啟動(dòng)炎癥應(yīng)答,促進(jìn)機(jī)體固有免疫應(yīng)答和后天獲得性的免疫應(yīng)答,以達(dá)到防御感染、維護(hù)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的目的。啟動(dòng)炎癥體形成的感受器蛋白主要包括有兩大家族:NLR家族(NOD樣蛋白家族)和ALR(AIM2樣蛋白家族)家族,它們

2、在病原菌相關(guān)模式分子(PAMPs)和組織損傷相關(guān)模式分子(DAMPs)刺激下,招募接頭蛋白和pro-caspase-1,組裝成為約700kD的巨分子復(fù)合物——炎癥體,聚集在一起的pro-caspase-1通過自體切割方式導(dǎo)致caspase-1活化,活化的caspase-1進(jìn)一步切割pro-IL-1β和pro-IL-18,生成活性IL-1β和IL-18,并促進(jìn)它們分泌到細(xì)胞外來發(fā)揮各種炎癥效應(yīng);或通過誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(pyroptosis)來

3、啟動(dòng)炎癥。
　　NLR(NOD-like receptor)家族是啟動(dòng)的炎癥體形成的主要感受器蛋白,NLR家族成員包括NLRP1、NLRP3、NLRC4和NLRP6。在分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上,NLR家族包含:核苷酸連接區(qū)域和寡聚化結(jié)構(gòu)域(NACHT),位于兩側(cè)的通常分別是C-端富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRRs)和N-端招募caspase的結(jié)構(gòu)域(CARD)或熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)。目前認(rèn)為LRRs在配體識(shí)別和蛋白質(zhì)自身調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用,而C

4、ARD功能域和PYD功能域,可通過調(diào)控同型蛋白質(zhì)相互作用介導(dǎo)下游信號(hào)。NACHT結(jié)構(gòu)域是唯一所有NLR家族成員所共有的結(jié)構(gòu)域,可通過依賴ATP的寡聚化作用激活信號(hào)復(fù)合體。NLRP3沒有CARD功能域,因此,需要先通過它的PYD功能域招募adaptor蛋白ASC,再通過ASC的CARD功能域征募caspase-1酶原來活化caspase-1。
　　在活化信號(hào)上,NLR家族擁有眾多的活化信號(hào),其中,NLRP3的活化信號(hào)最為廣泛多樣,N

5、LRP3炎癥體可以在眾多病原體(細(xì)菌、病毒、真菌)或非病原體來源刺激物(比如ATP、尿酸、硅晶體、淀粉樣蛋白β)刺激下活化,參與炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展,但NLRP3蛋白質(zhì)分子被認(rèn)為不可能通過物理作用結(jié)合結(jié)構(gòu)如此多樣的信號(hào)分子。因此,很可能通過某些共同的中間途徑引起NLRP3炎癥體的活化,目前已經(jīng)提出了三條活化途徑,包括:(1)NLRP3活化劑ATP可以通過泛連接蛋白半通道引起P2X7-依賴的細(xì)胞膜孔的形成,因此導(dǎo)致細(xì)胞外的NLRP3激活

6、物通過細(xì)胞膜孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)直接活化NLRP3;(2)內(nèi)吞入細(xì)胞的微粒和晶狀體,它們的物理特性損傷溶酶體,引起溶酶體內(nèi)容物(例如,組織蛋白酶B)釋放到胞漿活化NLRP3炎癥體;(3)包括ATP、微粒、晶體等在內(nèi)的各種DAMPs和PAMPs都可以引起細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS產(chǎn)生,并通過依賴活性氧ROS途徑來活化NLRP3炎癥體。近來有證據(jù)進(jìn)一步顯示,也許這3個(gè)不同的途徑都是通過鉀離子外流的增加這一共同途徑,導(dǎo)致NLRP3炎癥體活化。
　　目前

7、已經(jīng)有部分研究涉及到了炎癥體功能失調(diào)與各種臨床疾病的關(guān)系,證實(shí)NLRP3炎癥體在抗病毒、心血管疾病等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。研究證實(shí)炎癥體可參與機(jī)體抗菌固有免疫應(yīng)答,甲型流感病毒是NLRP3的間接活化劑。感染甲型流感病毒時(shí),機(jī)體可通過依賴Toll樣受體7(TLR7,Toll-like receptor7)識(shí)別病毒RNA,并引起NLRP3炎癥體組分轉(zhuǎn)錄水平升高。隨后,活化的病毒M2離子通道蛋白引起反面高爾基網(wǎng)(即分泌面高爾基網(wǎng)

8、絡(luò))PH中和作用,進(jìn)一步引起鉀離子外流和活性氧ROS形成,促進(jìn)NLRP3炎癥體活化。如我們所知,膽固醇沉積于動(dòng)脈血管是動(dòng)脈粥樣硬化特異性的病征,膽固醇晶體通過破壞吞噬溶酶體穩(wěn)定性方式,活化弱氧化修飾低密度脂蛋白(mmLDL,minimal modified low density lipoprotein)預(yù)激的小鼠和人巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥體。不僅如此,研究者發(fā)現(xiàn),通過骨髓再造(使缺乏NLRP3,ASC或 IL-1α/β),明顯的抑制

9、了低密度脂蛋白LDL受體基因敲除小鼠(易患動(dòng)脈粥樣硬化)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,提示造血系統(tǒng)NLRP3炎癥體活化和IL-1分泌在動(dòng)脈粥樣硬化疾病早期階段扮演重要的角色。
　　慢性乙型肝炎是由嗜肝病毒HBV感染肝細(xì)胞導(dǎo)致的慢性肝臟損傷。全球超過50％肝癌是繼發(fā)于慢性乙型肝炎,雖然臨床抗病毒治療使慢性乙型肝炎向肝癌的轉(zhuǎn)歸得到部分控制,但仍然有約一半的病人難以完全控制肝臟持續(xù)的炎癥性損傷,以及慢性肝硬化轉(zhuǎn)歸的結(jié)局。已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道,IL-

10、1β可能在在肝纖維化過程中具有重要的促進(jìn)作用,由于IL-1β同時(shí)也是炎癥體活化的重要產(chǎn)物,我們高度懷疑炎癥體功能失調(diào)可能在慢性乙型肝炎的進(jìn)展中具有重要作用。介于NLRP3炎癥體有著廣泛多樣的活化信號(hào),并且也證實(shí)在機(jī)體其他慢性炎性疾病中具有重要作用,NLRP3炎癥體功能失調(diào)參與慢性乙型肝炎的疾病進(jìn)展的可能最大。另外,越來越多的證據(jù)表明,有許多非骨髓來源細(xì)胞也表達(dá)的 NLRP3炎癥體,比如脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞/心肌成纖維細(xì)胞等,并在糖尿病、心

11、肌梗死等相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演重要角色。肝臟主要由組成細(xì)胞是實(shí)質(zhì)細(xì)胞,占到了肝臟體積的80%,而包括肝星形細(xì)胞(HSC)、枯否細(xì)胞(KC)和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)等在內(nèi)的肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞僅占肝體積的6.5%。因此,我們擬通過了解 NLRP3炎癥體各組分在慢性乙肝病人肝組織和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)和功能,來初步判斷 NLRP3炎癥體是否有可能參與慢性乙肝的發(fā)病,為進(jìn)一步深入研究NLRP3炎癥體在慢性乙型肝炎中的功能奠定基礎(chǔ)。
　　綜上

12、,本課題研究分為兩個(gè)部分,第一部分為檢測NLRP3炎癥體各組分在原位肝組織和肝細(xì)胞株的表達(dá),通過細(xì)胞免疫組化、Western blot等確定人正常肝細(xì)胞株L02和人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞內(nèi)均有NLRP3炎癥體及相關(guān)部件的表達(dá)(以Thp-1細(xì)胞株作為陽性對(duì)照),也發(fā)現(xiàn)NLRP3、caspase-1、IL-1β在乙型肝炎肝組織與正常肝組織切片均有表達(dá),乙型肝炎病人中NLRP3炎癥體表達(dá)明確,但在正常肝組織切片中,表達(dá)較弱。第二部分研究NL

13、RP3炎癥體在肝細(xì)胞中的功能,主要通過相應(yīng)的危險(xiǎn)信號(hào)刺激,檢測肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥體是否具有相應(yīng)的炎癥響應(yīng)功能。結(jié)果顯示在內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)ATP的刺激下,肝細(xì)胞株HepG2/L02的IL-1β分泌明顯增高,肝癌細(xì)胞株HepG2表現(xiàn)出比胎肝細(xì)胞株L02更高的IL-1β分泌能力,但肝細(xì)胞總體上的炎癥響應(yīng)能力都弱于單核-巨噬細(xì)胞,在1.5×106接種,1.5ml體系培養(yǎng),5Mm ATP刺激6h(100ng/ml LPS預(yù)激12h)的同等情

14、況下,Thp-1分泌的IL-1β為500-1000pg/ml, HepG2為300-600pg/ml,L02僅為20-50pg/ml,但考慮到肝臟中肝細(xì)胞的總體數(shù)量,因此,在慢性乙型肝炎疾病進(jìn)程中,肝細(xì)胞來源的炎癥應(yīng)答能力不可小覷?？傊?本研究旨在明確肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥體的表達(dá)和炎癥應(yīng)答能力,為進(jìn)一步探究NLRP3炎癥體在CHB疾病進(jìn)程中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)或提供理論線索。
　　一、實(shí)驗(yàn)方法:
　　1)第一部分:NLR

15、P3炎癥體在肝細(xì)胞中的表達(dá)
　　1.通過細(xì)胞免疫組化和細(xì)胞免疫熒光法,檢測正常肝細(xì)胞株L02和人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥體及相關(guān)部件的表達(dá)情況,并以單核-巨噬細(xì)胞株Thp-1作為陽性對(duì)照;
　　2.通過免疫組化或免疫熒光檢測乙型肝炎肝組織與正常肝組織NLRP3炎癥體、caspase-1、IL-1β的表達(dá)(以扁桃體組織作為陽性對(duì)照),以明確NLRP3炎癥體及炎癥體相關(guān)部件在乙型肝炎肝組織和正常肝組織中的原位表達(dá)

16、情況和表達(dá)差異;
　　3.通過Western Blot檢測胎肝細(xì)胞株L02、肝癌細(xì)胞株HepG2和肝組織中內(nèi)NLRP3炎癥體的表達(dá),以明確NLRP3炎癥體在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝組織內(nèi)的蛋白分子表達(dá)情況,并以GAPDH表達(dá)量為內(nèi)參,利用Quanity One軟件半定量分析NLRP3炎癥體在乙型肝炎肝組織和正常肝組織中的蛋白分子表達(dá)水平的差異;
　　2)第二部分:NLRP3炎癥體在肝細(xì)胞內(nèi)的功能
　　1.通過RT-PCR、RT-

17、real-time PCR檢測LPS炎性刺激對(duì)胎肝細(xì)胞株L02和肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞內(nèi)caspase-1、IL-1β基因表達(dá)的影響,以了解炎性刺激對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)炎癥體相關(guān)部件基因表達(dá)水平的影響;
　　2.ATP作為 NLRP3炎癥體的經(jīng)典激活劑,LPS、LPS+ATP分組刺激肝細(xì)胞株L02/HepG2,并通過Western Blot檢測L02/HepG2胞內(nèi)caspase-1活化片段;通過ELISA檢測在LPS、LPS/ATP或L

18、PS/ATP/Y-VAD-fmk刺激下,肝細(xì)胞株L02/HepG2和單核巨噬細(xì)胞株Thp-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18分泌情況,以明確正常肝細(xì)胞NLRP3炎癥體是否為功能性表達(dá),能否對(duì)內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)具有明確的炎癥響應(yīng)。
　　二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.免疫組化和免疫熒光的結(jié)果顯示,在HepG2/L02肝細(xì)胞內(nèi)檢測到有NLRP3和capsape-1表達(dá)不明顯,LPS刺激24h可促進(jìn)NLRP3炎癥體在HepG2/L02中的

19、表達(dá);在正常肝組織內(nèi)NLRP3、caspase-1、IL-1β雖然有表達(dá),但表達(dá)水平很低,而乙型肝炎肝組織 NLRP3炎癥體的表達(dá)較正常肝組織顯著增高,免疫組化未檢測到caspase-3在乙肝肝組織中表達(dá);
　　2.RT-PCR、RT-real-time PCR結(jié)果顯示,LPS刺激18h左右,L02、HepG2肝細(xì)胞內(nèi) caspase-1、IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均增高;而LPS短時(shí)的刺激在4h左右稍微增高,說明這兩株肝實(shí)質(zhì)細(xì)

20、胞對(duì)LPS刺激的應(yīng)答可能不夠敏感,需要較長時(shí)間刺激才能夠上調(diào)炎癥體的相關(guān)組分的表達(dá);
　　3.Western Blot結(jié)果顯示,L02肝細(xì)胞、HepG2肝細(xì)胞和肝組織內(nèi)均表達(dá)NLRP3炎癥體,其中Quanity One結(jié)果分析顯示乙肝肝組織中NLRP3炎癥體的表達(dá)水平較正常肝組織蛋白表達(dá)水平明顯升高;不僅如此,內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)ATP刺激活化L02/HepG2胎肝細(xì)胞株胞內(nèi)NLRP3炎癥體,活化的炎癥體進(jìn)一步招募并切割pro-casp

21、ase-1,使成生成更多caspase-1活性P10亞基;
　　4.ELISA結(jié)果顯示,內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)ATP顯著的促進(jìn)L02胎肝細(xì)胞株IL-1β和IL-18分泌,不僅如此,caspase-1特異性阻斷劑Y-VAD-fmk可抑制ATP介導(dǎo)的L02胎肝細(xì)胞株IL-1β和IL-18分泌,因此ATP介導(dǎo)的L02胎肝細(xì)胞株IL-1β和IL-18分泌依賴肝細(xì)胞內(nèi)caspase-1的活化。
　　三、結(jié)論:
　　1.L02肝細(xì)胞、He

22、pG2肝細(xì)胞和肝組織中均表達(dá)有NLRP3炎癥體,并且,肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的NLRP3炎癥體可識(shí)別內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)ATP活化caspase-1,分泌IL-1β和IL-18,說明了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的NLRP3炎癥體具有識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)啟動(dòng)炎癥應(yīng)答的能力。
　　2.與骨髓來源的Thp-1細(xì)胞相比,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的炎癥響應(yīng)能力較弱,在同等程度的危險(xiǎn)信號(hào)刺激下,L02胎肝細(xì)胞株IL-1β的分泌量僅是Thp-1的1/50-1/10,但HepG2肝癌細(xì)胞株可達(dá)

23、到Thp-1的1/3-1/2,再考慮到肝組織局部的肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞的比例,我們認(rèn)為肝細(xì)胞內(nèi)的NLRP3炎癥體具有參與慢性乙型肝炎炎性損傷的可能,但還需要進(jìn)一步的研究來提供證據(jù)。
　　3.慢性乙型肝炎肝組織細(xì)胞內(nèi)NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達(dá)較正常肝組織顯著增高,說明肝細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥體可能參與慢性乙型肝炎的疾病進(jìn)程。綜上,本課題對(duì)肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥體的表達(dá)和炎癥應(yīng)答能力進(jìn)行了初步研究