NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中的作用.pdf

1、背景:目前冠心病(CAD)已成為發(fā)達國家患者死亡的首要原因。以血管壁功能紊亂及斑塊形成為特征的動脈粥樣硬化是冠心病形成及發(fā)展的主要病理過程。內(nèi)皮功能紊亂引起的自由基增加，低密度脂蛋白(LDL)、感染性微生物、剪切應(yīng)力、毒素、高血壓等因素的共同作用會誘導慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生最終導致動脈粥樣硬化的形成。慢性炎癥反應(yīng)是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的重要推動力，動脈壁的脂質(zhì)沉積以及外周血炎性細胞的浸潤被認為是動脈粥樣硬化斑塊形成及發(fā)展的主要標志。<

2、br>　　 近年來的研究提示先天免疫模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)介導的炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。它們通過識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)以及內(nèi)源性危險信號(endogenous danger signals，DAMPs)使免疫細胞受到活化并分泌一系列的細胞因子從而促進動脈

3、壁的炎癥反應(yīng)過程。NLRP3炎癥小體是剛剛引起關(guān)注的一種細胞內(nèi)模式識別受體，當配體與NLRP3結(jié)合后促進炎癥小體的形成，并對caspase-1進行自身激活，最終導致IL-1β和IL-18的成熟及分泌?，F(xiàn)有研究結(jié)果提示NLRP3炎癥小體可能參與了動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但是部分研究結(jié)論仍然存在矛盾。因此，清楚認識NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在動脈粥樣硬化中的作用，對于認識細胞內(nèi)模式識別受體在人動脈粥樣硬化形成及發(fā)展中的作用具有重

4、要意義。
　　 方法:該實驗主要分為兩大部分:第一部分觀察臨床冠心病患者外周血單核細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子的表達情況。通過ELISA，real-time PCR和Western Blot等方法對20例健康對照以及64例不同程度冠心病(穩(wěn)定性心絞痛，不穩(wěn)定性心絞痛)患者外周血單核細胞NLRP3及其下游炎癥因子的mRNA和蛋白表達水平進行檢測;觀察30例急性ST段抬高型心肌梗死患者NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子的

5、動態(tài)表達，共選取4個時間點依次為:胸痛發(fā)作6小時以內(nèi)，胸痛發(fā)作后48～72小時，心肌梗死發(fā)病后1周以及心肌梗死后4～6周，通過ELISA，real-time PCR的方法對急性ST段抬高型心肌梗死患者發(fā)病不同時間點的外周血單核細胞內(nèi)NLRP3及其下游炎癥因子的表達進行觀察。第二部分，從細胞水平探討NLRP3炎癥小體的作用，采用ox-LDL、ox-HDL、HDL三種脂蛋白分別作用于人單核細胞系Thp-1之后，觀察NLRP3及其下游炎癥因子

6、的表達變化;通過RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建NLRP3小干擾RNA下調(diào)NLRP3基因表達，再次給予ox-LDL、ox-HDL、HDL，觀察下調(diào)NLRP3基因表達后對下游caspase-1、IL-1β和IL-18活化情況的影響;觀察人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV304中是否存在NLRP3及其下游炎癥因子的表達，同樣給予ox-LDL、ox-HDL、HDL作用后觀察NLRP3及其下游炎癥因子的表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.NLRP3及

7、其下游炎癥因子在冠心病患者中隨冠心病的病情及冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度增加而表達逐漸增加;
　　 2.NLRP3及其下游炎癥因子在急性ST段抬高型心肌梗死發(fā)病過程中的4個時間點:胸痛發(fā)作6小時以內(nèi)(3.5±1.1小時)，胸痛發(fā)作后48～72小時(57.0±9.4小時)，心肌梗死發(fā)病后1周(7±1天)以及心肌梗死后4～6周(5.1±0.7周)具有動態(tài)變化;
　　 3.氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，氧化高密度脂蛋白(ox

8、-HDL)作用于單核細胞后可以促進NLRP3表達，并進一步活化NLRP3炎癥小體下游的caspase-1，誘發(fā)IL-1β和IL-18的分泌，這種活化效應(yīng)具有濃度依賴性;高密度脂蛋白(HDL)作用于單核細胞隨作用濃度的升高NLRP3及其下游炎癥因子的表達逐漸減弱;干預NLRP3炎癥小體能夠明顯抑制細胞因子的產(chǎn)生;
　　 4.在人臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV304中存在NLRP3及其下游炎癥因子的mRNA和蛋白水平的表達;給予氧化低密度脂

9、蛋白(ox-LDL)和氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)刺激后，能夠促進NLRP3及其下游炎癥因子的mRNA和蛋白水平的表達，促進炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-18的釋放。
　　 結(jié)論:
　　 1.NLRP3及其下游炎癥因子在冠心病患者中隨冠心病的病情及冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度增加而表達逐漸增加，提示NLRP3及其下游炎癥因子可能與冠心病的病情及動脈粥樣硬化病變嚴重程度相關(guān);
　　 2.NLRP3及其下游炎癥因子在急

10、性ST段抬高型心肌梗死發(fā)病過程中具有動態(tài)變化，提示NLRP3及其下游炎癥因子可能參與了急性ST段抬高型心肌梗死發(fā)病過程中的急性炎癥反應(yīng);
　　 3.在人單核細胞和內(nèi)皮細胞中都存在NLRP3及其下游炎癥因子的表達，在脂蛋白的作用下能夠表現(xiàn)出不同程度的活化和抑制作用，干預NLRP3炎癥小體能夠明顯抑制細胞因子的產(chǎn)生，提示NLRP3炎癥小體在參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的多種細胞內(nèi)表達，誘導炎癥介質(zhì)的釋放，能夠全面參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展