NLRP3炎癥小體促進(jìn)草酸鈣腎結(jié)石形成機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　明確草酸鈣腎結(jié)石形成過程中NLRP3炎癥小體激活的機(jī)制，探討NLRP3炎癥小體促進(jìn)草酸鈣腎結(jié)石形成的機(jī)制。
　　方法：
　　通過免疫組化檢測(cè)分析人草酸鈣結(jié)石腎組織與正常腎組織組 NLRP3、Caspase-1及 IL-1β的表達(dá)水平差異；培養(yǎng) HK-2細(xì)胞，使用不同濃度的草酸（0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0mmol/L）處理細(xì)胞24h后，通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH的含量、DAP

2、I細(xì)胞核染色結(jié)果、MTT法以及CCK-8法分析草酸對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性及活性的影響；草酸與COM共培養(yǎng)于HK-2細(xì)胞24h后，使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞表面晶體的粘附情況；通過Western blotting法和RT-qPCR分別分析草酸作用于 HK-2細(xì)胞24h后對(duì) NLRP3、Caspase-1及 IL-1β蛋白水平及mRNA表達(dá)量的影響；應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)分析草酸作用于HK-2細(xì)胞24h后對(duì)HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及

3、CD44 mRNA表達(dá)量的影響；草酸作用于HK-2后，采用氧化敏感的熒光探針 DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞中 ROS；使用 ROS抑制劑NAC預(yù)處理HK-2細(xì)胞2h，然后草酸作用于HK-2細(xì)胞24h，Western blotting和RT-qPCR分別檢測(cè)分析NLRP3的蛋白水平及mRNA的表達(dá)量；使用RNA干擾技術(shù)，將NLRP3-SiRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后，相差顯微鏡觀察細(xì)胞表面晶體粘附變化RT-qPCR法分別檢測(cè)HAS1、HAS2、HA

4、S3、OPN以及CD44 mRNA表達(dá)水平變化；采用乙二醇法復(fù)制 SD大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型，通過 HE、Pizzolato染色法以及偏光顯微鏡觀察大鼠腎組織結(jié)石形成情況，并通過 Western blotting法和RT-qPCR檢測(cè)大鼠腎組織中NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白和mRNA表達(dá)差異,以及HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA表達(dá)水平變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理后均采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5、
　　結(jié)果：
　　免疫組化染色結(jié)果顯示人草酸鈣腎組織標(biāo)本中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的蛋白表達(dá)水平高于人正常腎組織，進(jìn)而說明草酸鈣腎結(jié)石形成過程中存在NLRP3炎癥小體的激活；培養(yǎng)基中 LDH含量測(cè)定結(jié)果顯示草酸濃度在0.8mmol/L時(shí)，LDH的含量顯著高于草酸濃度在0-0.6mmol/L(P＜0.05)，草酸濃度在0-0.8mmol/L時(shí)，DAPI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)各濃度梯度內(nèi)細(xì)胞數(shù)量沒有明顯差異，當(dāng)草酸濃度

6、1.0mmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)量開始顯著減少(P＜0.05)，MTT法以及CCK-8結(jié)果顯示草酸濃度為1.0mmol/L時(shí)(P＜0.05)，影響了細(xì)胞活性，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，造成了細(xì)胞損傷；草酸(0.8mmol/L)作用于HK-2細(xì)胞24h后，使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞表面COM晶體粘附數(shù)量明顯多于對(duì)照組（P＜0.05）；NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白水平和mRNA表達(dá)量在草酸(0.8mmol/L)作用于HK-2細(xì)

7、胞24h后均高于對(duì)照組（P＜0.05），且HK-2細(xì)胞表面粘附因子HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44的mRNA表達(dá)水平亦均高于對(duì)照組（P＜0.05）；采用DCFH-DA法檢測(cè)HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS，發(fā)現(xiàn)草酸(0.8mmol/L)可引起細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS，且加入ROS抑制劑NAC作用后NLRP3的蛋白水平及mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），進(jìn)而表明了高濃度草酸作用于HK-2細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS，

8、并導(dǎo)致NLRP3炎性體的激活；NLRP3-SiRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞表面晶體粘附數(shù)量顯著少于對(duì)照組（P＜0.05），且細(xì)胞內(nèi)粘附因子HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA表達(dá)量亦均低于對(duì)照組（P＜0.05）；使用乙二醇法構(gòu)建 SD大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型，通過 HE、Pizzolato染色法及偏光顯微鏡發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組大鼠腎組織內(nèi)晶體形成，且 NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白水平和mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)

9、照組（P＜0.05），組織內(nèi)粘附因子HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA表達(dá)量亦均高于對(duì)照組（P＜0.05），通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了NLRP3炎癥小體的激活參與了草酸鈣腎結(jié)石的形成。
　　結(jié)論：
　　草酸鈣腎結(jié)石形成過程中存在NLRP3炎癥小體的激活，NLRP3炎癥小體通過細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生而激活；NLRP3炎癥小體激活后通過改變腎小管上皮對(duì)晶體的粘附性進(jìn)而參與結(jié)石的形成；同時(shí)為草酸鈣腎結(jié)石的發(fā)生機(jī)制