p38 MAPK-PPARγ-NF-κB信號(hào)通路在腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受中的作用.pdf

1、目的:腦缺血性疾病已經(jīng)成為影響人類健康的最重要的疾病之一。大量研究證實(shí)，預(yù)先給予腦組織一個(gè)短暫、不引起神經(jīng)元損傷的缺血刺激可以提高神經(jīng)元對(duì)后續(xù)損傷性缺血打擊的耐受能力，這一現(xiàn)象稱為腦缺血耐受，預(yù)先給與的短暫腦缺血刺激稱為缺血預(yù)處理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信號(hào)通路是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白

2、激酶，是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞途徑，大量的研究證實(shí)，MAPKs信號(hào)通路參與腦缺血過(guò)程，并且可能與誘導(dǎo)腦缺血耐受有密切的關(guān)系。p38 MAPK作為MAPKs中的一種亞型，在誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到刺激被激活后，會(huì)使下游的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化，從而參與細(xì)胞內(nèi)多種生命活動(dòng)。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ)及

3、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factorkappa B，NF-κB)均屬于p38 MAPK的下游信號(hào)分子。PPARγ是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子之一，它參與機(jī)體內(nèi)脂類物質(zhì)的分化和代謝、能量轉(zhuǎn)換、炎癥反應(yīng)等多種生理及病理生理過(guò)程。NF-κB在靜息狀態(tài)下與IκB形成復(fù)合體存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，使IκB發(fā)生磷酸化并與NF-κB解離，使NF-κB激活，被激活的NF-κB參與到基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中。因此我們推測(cè)，CIP有可能通過(guò)p38 MAP

4、K-PPARγ/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)腦缺血耐受。另外，我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)，使用p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580、PPARγ的特異性拮抗劑GW9662和NF-κB的特異性拮抗劑BAY11-7082均可以阻斷CIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受作用。
　　反義寡聚脫氧核苷酸（antisense oligodeoxy-nucleotides，AS-ODNs）可以根據(jù)堿基互補(bǔ)原則結(jié)合目的基因，從而達(dá)到特異性的封閉目的基因和蛋白表達(dá)的

5、目的。為進(jìn)一步證實(shí)p38 MAPK-PPARγ/NF-κB信號(hào)通路在CIP誘導(dǎo)腦缺血耐受中的作用，本實(shí)驗(yàn)觀察應(yīng)用p38 MAPK AS-ODNs對(duì)CIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受、以及在此過(guò)程中p38 MAPK-PPARγ/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的變化。
　　方法:
　　1、CIP誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中p-p38 MAPK、PPARγ、NF-κB p50蛋白表達(dá)的變化
　　40只健康雄性Wistar大鼠(280～300 g)，

6、首先永久凝閉椎動(dòng)脈，恢復(fù)2天后，隨機(jī)分為以下4組:①sham組(n=10):只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不其阻斷血流;②CIP組(n=10):夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min，然后恢復(fù)血流再灌注;③腦缺血損傷組(ischemic insult，Ⅱ)(n=10):夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min，然后恢復(fù)血流再灌注;④CIP+Ⅱ組(n=10):先夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min作為CIP，再灌注2天后，再次夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min作為損傷性缺血處理，然后恢復(fù)血流

7、再灌注。以上各組均sham手術(shù)后或末次腦缺血再灌注后6h和2d（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5）斷頭取腦，分離海馬CA1區(qū)，應(yīng)用Western blot方法觀察p-p38 MAPK、PPARγ、NF-κB p50蛋白的表達(dá)。
　　2、p38 MAPK AS-ODNs對(duì)CIP誘導(dǎo)的PPARγ、NF-κB p50蛋白表達(dá)的影響
　　60只健康雄性Wistar大鼠(280～300 g)，首先永久凝閉椎動(dòng)脈，恢復(fù)2天后，隨機(jī)分為以下4組:①sha

8、m組(n=10);②CIP組(n=10);③p38 MAPK AS-ODNs+CIP組(n=30);④p38 MAPK S-ODNs+CIP組(n=10)。其中③組根據(jù)p38 MAPK AS-ODNs劑量不同，又分成5 noml、10 noml和15 noml3個(gè)亞組;④組中p38 MAPK S-ODNs劑量為15 noml。各（亞）組均分為6h、2d時(shí)間點(diǎn)（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5）。p38 MAPK AS-ODNs及p38 MAPK S-O

9、DNs均溶于15μl人工腦脊液(Aritificial cerebrospinalfluid，ACSF)中，于凝閉錐動(dòng)脈前1天開(kāi)始注射，每天1次，連續(xù)注射5天，至CIP后1天結(jié)束（其中CIP6 h時(shí)間點(diǎn)大鼠只能注射4次）。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，斷頭取大鼠腦組織，應(yīng)用Western blot方法觀察大鼠海馬CA1區(qū)CIP后PPARγ、NF-κB p50蛋白的表達(dá)。
　　3、p38 MAPK AS-ODNs對(duì)CIP誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中大鼠海

10、馬CA1區(qū)PPARγ、NF-κB p50蛋白表達(dá)的影響
　　50只健康雄性Wistar大鼠(280～300 g)，首先永久凝閉椎動(dòng)脈，恢復(fù)2天后，隨機(jī)分為以下3組:①CIP+Ⅱ組(n=10);②p38 MAPK AS-ODNs+CIP+Ⅱ組(n=30);③p38 MAPK S-ODNs+CIP+Ⅱ組(n=10)。其中②組根據(jù)p38 MAPK AS-ODNs劑量不同，又分成5 noml、10 noml和15 noml3個(gè)亞組，③組中

11、p38 MAPK S-ODNs劑量為15 noml。各（亞）組均分為6h和2d時(shí)間點(diǎn)（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5）。p38 MAPK AS-ODNs及p38 MAPK S-ODNs均溶于15μlACSF中，于凝閉錐動(dòng)脈前1天開(kāi)始注射，每天1次，連續(xù)注射5天，至CIP后1天結(jié)束。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，斷頭取大鼠腦組織，應(yīng)用Western blot方法觀察大鼠海馬CA1區(qū)PPARγ、NF-κBp50蛋白的表達(dá)。
　　4、p38 MAPK AS-ODN

12、s對(duì)CIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受的影響
　　45只健康雄性Wistar大鼠(280～300 g)，首先永久凝閉椎動(dòng)脈，恢復(fù)2天后，隨機(jī)分為以下7組:①sham組(n=5);②CIP組(n=5);③Ⅱ組(n=5);④CIP+Ⅱ組(n=5);⑤ACSF+CIP+Ⅱ組(n=5);⑥p38MAPK AS-ODNs+CIP+Ⅱ組(n=15);⑦p38 MAPK S-ODNs+CIP+Ⅱ組(n=5)。p38 MAPK AS-ODNs及p38 MAP

13、K S-ODNs均溶于15μl ACSF中，凝閉錐動(dòng)脈前1天開(kāi)始注射，至CIP后1天，共注射5次（每天1次，共5天），其余步驟同CIP+Ⅱ組。其中⑥組根據(jù)p38 MAPK AS-ODNs劑量不同，又分成5 noml、10 noml和15 noml3個(gè)亞組（各（亞）組n=5）。其中⑦組中p38 MAPK S-ODNs劑量為15 noml。所有大鼠均在sham手術(shù)之后或者末次全腦缺血/再灌注手術(shù)操作后7天，斷頭取出腦組織，應(yīng)用硫堇染色觀察大

14、鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的情況。
　　結(jié)果:
　　1、CIP誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中p-p38 MAPK、PPARγ、NF-κBp50蛋白表達(dá)的變化
　　Western blot分析顯示，在6h時(shí)間點(diǎn)，sham組大鼠海馬CA1區(qū)有一定量的p-p38 MAPK蛋白、PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)。與sham組相比，CIP使p-p38MAPK蛋白、PPARγ蛋白和NF-κBp50蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，分

15、別為基礎(chǔ)值的1.25倍、1.28倍和1.36倍(P＜0.05)。與sham組相比，Ⅱ打擊引起了p-p38 MAPK蛋白、PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表達(dá)更為明顯的上調(diào)，分別為基礎(chǔ)值的1.64倍、1.74倍和2.02倍(P＜0.01)。預(yù)先給與CIP，可明顯抑制Ⅱ打擊引起的p-p38MAPK、PPARγ和NF-κB p50蛋白的表達(dá)的過(guò)度上調(diào)，表現(xiàn)為與Ⅱ組相比， CIP+Ⅱ組的p-p38 MAPK、PPARγ和NF-κB p5

16、0蛋白的表達(dá)均明顯下降(P＜0.05)。在2d時(shí)間點(diǎn)，各組中p-p38 MAPK、PPARγ和NF-κB p50蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)與6h時(shí)間點(diǎn)一致。結(jié)果表明CIP引起p-p38 MAPK、PPARγ和NF-κB p50蛋白表達(dá)顯著升高，并可抑制缺血打擊引起的這些蛋白表達(dá)的過(guò)度上調(diào)。
　　2、p38 MAPK AS-ODNs對(duì)CIP誘導(dǎo)的PPARγ、NF-κB p50蛋白表達(dá)的影響
　　Western blot分析顯示，在6h

17、時(shí)間點(diǎn)，sham組大鼠海馬CA1區(qū)有一定量的PPARγ蛋白和NF-B p50蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)。與sham組相比，CIP組使PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.05)。在p38MAPK AS-ODNs+CIP組中，PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表達(dá)均明顯降低，且隨著p38 MAPK AS-ODNs劑量的增大，PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性降低。p38 MAPK S-ODNs+C

18、IP組與CIP組相比，PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。在2d時(shí)間點(diǎn)，各組中PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)同6h時(shí)間點(diǎn)一致。結(jié)果表明p38 MAPK AS-ODNs劑量依賴性地阻斷CIP后PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表達(dá)的上調(diào)。
　　3、p38 MAPK AS-ODNs對(duì)CIP誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中大鼠海馬CA1區(qū)PPARγ、NF-κB p50蛋白表達(dá)的影響

19、>　　Western blot分析顯示，在6h時(shí)間點(diǎn)，與CIP+Ⅱ組相比，p38 MAPKAS-ODNs+CIP+Ⅱ組PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表達(dá)均明顯降低，且隨著p38 MAPK AS-ODNs劑量的增大，PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性降低;p38 MAPK S-ODNs+CIP+Ⅱ組PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。在2d時(shí)間點(diǎn)，各組中PPARγ蛋白和N

20、F-κB p50蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)同6h時(shí)間點(diǎn)一致。結(jié)果表明p38MAPK AS-ODNs劑量依賴性地阻斷CIP誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中PPARγ蛋白和NF-κB p50蛋白表達(dá)的上調(diào)。
　　4、p38 MAPK AS-ODNs對(duì)CIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受的影響
　　在Sham組、CIP組中，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元致密有序的排列、共2～3層，胞核飽滿，核仁清晰，均未見(jiàn)神經(jīng)元受損，組織學(xué)的分級(jí)為0級(jí)，ND值分別為196.12±6.93

21、和182.67±10.07。同sham組相比，Ⅱ組出現(xiàn)了較明顯的遲發(fā)性的神經(jīng)元死亡，神經(jīng)元的密度明顯下降，組織學(xué)的分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)，ND值為17.33+6.11，顯著降低(P＜0.01)。在CIP+Ⅱ組與Ⅱ組相比，神經(jīng)元的存活狀態(tài)有明顯改善，即CIP可顯著抑制腦缺血損傷引起的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，ND值為178.67±6.11，明顯增高(P＜0.01)。ACSF+CIP+Ⅱ組與CIP+Ⅱ組相比，神經(jīng)元的存活狀態(tài)沒(méi)有發(fā)生改變，即注射腦脊液對(duì)神經(jīng)

22、元的存活狀態(tài)無(wú)影響，ND值為178.78+7.03，無(wú)差異(P＞0.05)。與ACSF+ CIP+Ⅱ組相比，p38 MAPK AS-ODNs+CIP+Ⅱ組出現(xiàn)了顯著的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，表現(xiàn)為組織學(xué)分級(jí)升高，錐體神經(jīng)元密度降低，且此種變化與p38 MAPK AS-ODNs的注射劑量呈明顯正相關(guān)。在p38MAPK S-ODNs+CIP+Ⅱ組中，海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元存活狀態(tài)良好，未見(jiàn)錐體神經(jīng)元受損，ND值為174.20+13.61，與ACS