腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過程中NF-κBP50、NF-κBP65以及PPARγ蛋白的表達(dá)變化.pdf

1、目的:以往大量的實(shí)驗(yàn)證明，預(yù)先給予輕微的、短時(shí)的、不至于對錐體神經(jīng)元造成損傷的腦缺血預(yù)處理(cerebral ischemic preconditioning，CIP)，可以減少缺血-再灌注損傷，產(chǎn)生腦缺血耐受(brain ischemictolerance，BIT)。腦缺血預(yù)處理對機(jī)體的保護(hù)作用實(shí)際上是通過啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。此理論自從1990年被日本著名科學(xué)家Kitagawa提出后，全世界許多科學(xué)家進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證

2、明了此觀點(diǎn)的正確性。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB信號通路屬于受調(diào)蛋白水解酶依賴的受體信號傳導(dǎo)通路，其與腫瘤的發(fā)生、生長、分化、凋亡、感染以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān);此外，NF-κ B在靜息狀態(tài)下與IκB在細(xì)胞的胞漿中形成復(fù)合體，當(dāng)某些因素刺激細(xì)胞時(shí)，可使IκB發(fā)生磷酸化并與NF-κB發(fā)生解離，從而使NF-κB激活，被激活的NF-κB參與到基因轉(zhuǎn)錄過程中。NF-κB有許

3、多亞型，而P50和P65就是其中最重要的兩個(gè)，它們在協(xié)調(diào)免疫功能以及抗感染方面有著重要的作用。但在腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐過程中不同時(shí)間段如何變化目前尚不清楚。
　　過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome prolifer atoractivatedreceptors，PPAR)是一類可被配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，其對細(xì)胞的生長、分化、凋亡等具有重要調(diào)節(jié)作用。PPAR包括3種亞型，即PPARα、PPARβ、PPARγ

4、。其中PPARγ被激活后可以產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，可以很好的保護(hù)腦組織對抗機(jī)體的缺血性打擊，而且在許多臨床疾病中如:肝硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓以及高血脂等具有很好的緩解效果?；谝陨戏治觯緦?shí)驗(yàn)旨在觀察腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過程中在海馬CA1區(qū)NF-κB P50和P65以及PPARγ蛋白表達(dá)的變化，從而為臨床上腦缺血疾病的預(yù)防和治療提供相應(yīng)的理論依據(jù)。
　　方法:采用四血管閉塞全腦缺血模型，選用健康雄性Wistar大鼠(280

5、-300g)102只，隨機(jī)分為以下六組:
　　(1) control組(n=3):不進(jìn)行任何處理。
　　(2) sham組(n=3):暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但均不阻斷其血流。
　　(3)凝閉椎動(dòng)脈（vertebral artery occlusion，VAO）組(n=24):永久性凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，48 h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流。
　　(4) CIP組(n=24):永久性凝閉椎動(dòng)脈，48 h后夾

6、閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3min后恢復(fù)血流再灌注。
　　(5)損傷性缺血(ischemic insult，Ⅱ)組(n=24):永久性凝閉椎動(dòng)脈，48 h后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min后恢復(fù)血流再灌注。
　　(6) CIP+Ⅱ組(n=24):永久性凝閉椎動(dòng)脈，48 h后先夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min，然后恢復(fù)血流再灌注48 h后，再夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min后恢復(fù)血流再灌注。
　　除control組和sham組之外，其余4組都選取8個(gè)

7、時(shí)間點(diǎn)，分別是假手術(shù)處理后或末次缺血后的0 min、15 min、30 min、1h、3h、6h、2d、7d(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=3)。
　　在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，斷頭取大鼠的腦組織，通過應(yīng)用硫堇染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的存活情況;通過免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)觀察NF-κB P50、P65、PPARγ蛋白在大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)程度以及變化趨勢。
　　結(jié)果:
　　1神經(jīng)病理學(xué)評價(jià)

8、>　　通過對大鼠腦片進(jìn)行硫堇染色可以觀察到，control組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列致密有序、整齊、2-3層，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核清晰可見，核仁飽滿。與control組對比，Sham組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)無顯著變化，ND無顯著差異(P＞0.05)。VAO組與sham組對比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)無顯著變化，ND無顯著差異(P＞0.05)。
　　CIP組各時(shí)間點(diǎn)CA1區(qū)的神經(jīng)元均未見顯著損傷，與VAO組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，細(xì)胞形態(tài)無

9、顯著變化，ND無顯著差異(P＞0.05)。
　?、蚪M6h之內(nèi)CA1區(qū)的神經(jīng)元未見顯著損傷;2d時(shí)可見部分細(xì)胞萎縮、變性、壞死，核仁萎縮，細(xì)胞排列開始變得不規(guī)則;7d時(shí)可見大量細(xì)胞變性壞死，正常的神經(jīng)元幾乎不可見。與VAO組相比，2d和7d時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)有顯著變化，ND顯著降低(P＜0.05)。
　　CIP+Ⅱ組即刻時(shí)間點(diǎn)、6h時(shí)間點(diǎn)、2d時(shí)間點(diǎn)CA1區(qū)神經(jīng)元均無顯著受損;在7d時(shí)間點(diǎn)有個(gè)別細(xì)胞丟失壞死，細(xì)胞排列較為規(guī)則。與Ⅱ

10、組對比，7d時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量顯著增多，核仁清晰，細(xì)胞排列規(guī)則，具有顯著差異（P＜0.05）
　　2在腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過程中，大鼠海馬CA1區(qū)NF-κBP50蛋白表達(dá)的對比以及變化趨勢
　　Control組、sham組以及VAO組，可見NF-κB P50蛋白在胞核內(nèi)幾乎不表達(dá)，但胞漿內(nèi)有一定數(shù)量的表達(dá)。Sham組與control組相對比，蛋白表達(dá)量無顯著差異(P＞0.05);VAO組與Sham組相對比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)蛋白表

11、達(dá)量亦無顯著變化(P＞0.05)。
　　CIP組即刻時(shí)間點(diǎn)NF-κB P50蛋白在胞核內(nèi)幾乎不表達(dá)，但在胞漿內(nèi)有一定表達(dá)量。從30 min起，NF-κB P50蛋白逐漸在胞核內(nèi)開始有所表達(dá)，積分光密度也顯著增加(P＜0.05);從1h開始，胞核內(nèi)NF-κB P50的表達(dá)更加顯著，到了6h時(shí)，蛋白表達(dá)在胞核內(nèi)達(dá)到頂峰(P＜0.05)。2d時(shí)，胞核內(nèi)NF-κB P50蛋白表達(dá)量顯著減少，積分光密度也顯著下降，幾乎達(dá)到了VAO組相應(yīng)時(shí)間

12、點(diǎn)的水平(P＞0.05)。此水平一直持續(xù)至7d時(shí)間點(diǎn)。
　?、蚪M即刻時(shí)間點(diǎn)NF-κB P50在胞核內(nèi)幾乎不表達(dá)，但在胞漿內(nèi)有一定表達(dá)量。從30 min開始，胞核內(nèi)蛋白表達(dá)量有了顯著升高，與VAO組相比，30 min、1h、3h、6h時(shí)間點(diǎn)胞核內(nèi)的蛋白表達(dá)量有了顯著升高，積分光密度也隨之升高，并在6h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到頂峰(P＜0.05)，此時(shí)胞漿內(nèi)與胞核內(nèi)均可見大量蛋白表達(dá)。2d時(shí)間點(diǎn)NF-κB P50蛋白含量顯著下降，降低至VAO組相應(yīng)

13、時(shí)間點(diǎn)水平(P＞0.05)。7d時(shí)間點(diǎn)由于神經(jīng)元大量死亡，NF-κB P50蛋白含量顯著下降，與VAO組相對比有顯著降低(P＜0.05)。
　　CIP+Ⅱ組即刻時(shí)間點(diǎn)NF-κB P50在胞核內(nèi)幾乎不表達(dá)，但在胞漿內(nèi)有一定的表達(dá)量。從30 min開始，胞核內(nèi)開始逐漸出現(xiàn)蛋白表達(dá)，積分光密度也開始有所上升，但與即刻時(shí)間點(diǎn)相比差異仍不明顯(P＞0.05);與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，1h、3h、6h時(shí)間點(diǎn)胞核內(nèi)蛋白含量有了顯著上升(P＜0.05)

14、。2d時(shí)間點(diǎn)胞核內(nèi)表達(dá)量顯著降低，積分光密度也開始降低，幾乎達(dá)到了VAO組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的水平。
　　對比各組6h時(shí)間點(diǎn)NF-κB P50蛋白的表達(dá)數(shù)量，與VAO組對比，CIP組、Ⅱ組此時(shí)間點(diǎn)NF-κB P50蛋白含量均顯著升高(P＜0.05);與CIP組相比，Ⅱ組NF-κB P50蛋白含量進(jìn)一步增高(P＜0.05);與Ⅱ組相比，CIP+Ⅱ組蛋白含量顯著下降(P＜0.05)。
　　對比各組7d時(shí)間點(diǎn)NF-κ B P50的表達(dá)數(shù)量

15、，與VAO組相對比，CIP組NF-κB P50蛋白含量無顯著差異(P＞0.05)，Ⅱ組顯著下降（P＜0.05）;與Ⅱ組相比，CIP+Ⅱ組NF-κB P50蛋白含量顯著上升(P＜0.05)。
　　3在腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過程中，大鼠海馬CA1區(qū)NF-κBP65蛋白表達(dá)的對比以及變化趨勢
　　Control組、sham組以及OVA組NF-κB P65蛋白在胞核和胞漿中均有一定程度的表達(dá)。
　　CIP組NF-κB P6

16、5蛋白表達(dá)在30 min時(shí)間點(diǎn)之前未見顯著變化(P＞0.05);從1h時(shí)間點(diǎn)起積分光密度顯著增加，3h、6h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步增高，胞核和胞漿內(nèi)均有大量蛋白表達(dá)，并于6h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到頂峰（P＜0.05）;此后的變化趨勢與NF-κB P50的一致。
　?、蚪MNF-κB P65蛋白表達(dá)在15 min時(shí)間點(diǎn)之前未見顯著變化;從30min時(shí)間點(diǎn)起積分光密度顯著增加，1h、3h、6h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步增高，胞核和胞漿內(nèi)均有大量蛋白表達(dá)，并于6h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到

17、頂峰;2d時(shí)間點(diǎn)，NF-κB P65蛋白表達(dá)顯著減少，尤其以胞核中減少為主，但表達(dá)量仍高于VAO組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05);此后的變化趨勢與NF-κκB P50的一致。
　　CIP+Ⅱ組NF-κB P65蛋白表達(dá)在15 min時(shí)間點(diǎn)之前未見顯著變化;從30 min時(shí)間點(diǎn)起積分光密度顯著增加，1h、3h、6h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步增高，胞核和胞漿內(nèi)均有大量蛋白表達(dá)，并于6h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到頂峰。此后的變化趨勢與NF-κB P50的一致。
　

18、　對比各組6h時(shí)間點(diǎn)NF-κB P65蛋白的表達(dá)數(shù)量，與VAO組對比，CIP6 h、Ⅱ6h時(shí)間點(diǎn)蛋白含量有顯著上升(P＜0.05)。與Ⅱ6h時(shí)間點(diǎn)相比，CIP+Ⅱ6 h時(shí)間點(diǎn)蛋白含量有顯著下降(P＜0.05)。
　　對比各組7d時(shí)間點(diǎn)NF-κB P65蛋白的表達(dá)數(shù)量，與VAO組對比，CIP7 d時(shí)間點(diǎn)蛋白含量無明顯差異(P＞0.05)，Ⅱ7d時(shí)間點(diǎn)顯著下降(P＜0.05)。與Ⅱ6h時(shí)間點(diǎn)相比，CIP+Ⅱ6 h時(shí)間點(diǎn)蛋白含量有顯著上

19、升(P＜0.05)。
　　4在腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過程中，大鼠海馬CA1區(qū)PPARγ蛋白表達(dá)的對比以及變化趨勢
　　Control組、sham組以及VAO組可見PPARγ蛋白在胞核和胞漿內(nèi)均有一定程度的表達(dá)。
　　CIP組PPARγ蛋白表達(dá)在15 min時(shí)間點(diǎn)之前未見顯著變化(P＞0.05);從30 min時(shí)間點(diǎn)起積分光密度顯著增加，1h、3h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步增高，胞核和胞漿內(nèi)均有大量蛋白表達(dá)，并于3h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到頂峰

20、(P＜0.05)。在6h、2d、7d時(shí)間點(diǎn)時(shí)，胞核內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)量顯著下降，幾乎達(dá)到了VAO組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的水平。
　?、蚪MPPARγ蛋白表達(dá)在15 min時(shí)間點(diǎn)之前未見顯著變化(P＞0.05);從30min時(shí)間點(diǎn)起積分光密度顯著增加，1h、3h、6h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步增高，胞核和胞漿內(nèi)均有大量蛋白表達(dá)，并于6h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到頂峰(P＜0.05)。2d、7d時(shí)間點(diǎn)由于神經(jīng)元大量死亡，所以PPARγ蛋白含量顯著下降，與VAO組相對比有顯著

21、下降（P＜0.05）。
　　CIP+Ⅱ組PPARγ蛋白表達(dá)在1h時(shí)間點(diǎn)之前未見顯著變化(P＞0.05);從3h時(shí)間點(diǎn)起PPARγ蛋白表達(dá)顯著增加，6h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步增高，胞核和胞漿內(nèi)均有大量蛋白表達(dá)，并達(dá)到峰值(P＜0.05)。此后的變化趨勢與P50的一致。
　　對比各組6h時(shí)間點(diǎn)PPARγ蛋白的表達(dá)數(shù)量，與VAO組對比，CIP組此時(shí)間點(diǎn)PPARγ蛋白含量無顯著差異(P＞0.05)，Ⅱ組此時(shí)間點(diǎn)PPARγ蛋白含量有顯著增高(P

22、＜0.05);與CIP組相比，Ⅱ組PPARγ蛋白含量顯著增高(P＜0.05);與Ⅱ組相比，CIP+Ⅱ組蛋白含量顯著下降(P＜0.05)。
　　對比各組7d時(shí)間點(diǎn)PPARγ蛋白的表達(dá)數(shù)量，與VAO組相對比，CIP組PPARγ蛋白含量無顯著差異(P＞0.05)，Ⅱ組顯著下降(P＜0.05);與Ⅱ組相比，CIP+Ⅱ組PPARγ蛋白含量顯著上升(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1腦缺血預(yù)處理適度上調(diào)NF-κB P50、NF-