肢體缺血預(yù)處理腦保護(hù)作用及上調(diào)p38 MAPK的神經(jīng)機(jī)制.pdf

1、目的:腦缺血性疾病是危害人類健康的常見病、多發(fā)病。不可忽視的問題是，神經(jīng)元對缺血性損害極為敏感，經(jīng)過一定時(shí)間的缺血后，神經(jīng)元會大量死亡，即使恢復(fù)血液供應(yīng)，亦難以再生，給患者留下嚴(yán)重的后遺癥。因此，提高神經(jīng)元對缺血性損害的抵抗力，使其在蒙受嚴(yán)重的缺血時(shí)減輕損傷、保持存活，以保證恢復(fù)血液供應(yīng)后仍具有正常的生理功能，是此類疾病治療上的一個(gè)重要策略。
　　繼日本學(xué)者Kitagawa等首次發(fā)現(xiàn)短暫性腦缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)腦缺血耐受的現(xiàn)象后，大

2、量的研究人員進(jìn)行了此方面的研究，并證實(shí)了這種同一器官的缺血預(yù)處理的保護(hù)作用。盡管腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受是一種強(qiáng)大的內(nèi)源性保護(hù)作用，然而對中樞器官進(jìn)行缺血預(yù)處理，很難作為一種預(yù)防措施直接應(yīng)用于臨床。隨著對缺血預(yù)處理途徑和方法的進(jìn)一步研究，又相繼發(fā)現(xiàn)了肢體、腎臟及小腸等遠(yuǎn)隔器官的短暫性缺血可對后續(xù)的缺血再灌注損傷的心肌發(fā)揮保護(hù)作用，這種通過不同器官缺血預(yù)處理發(fā)揮保護(hù)作用的現(xiàn)象稱為遠(yuǎn)端器官缺血預(yù)處理(remote ischemic pre

3、conditioning，RIPC)。
　　我室既往研究證實(shí)，反復(fù)3次股動脈夾閉和再灌注的肢體缺血預(yù)處理（limb ischemic preconditioning，LIP）可減輕隨后即刻發(fā)生的腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元延遲性死亡和凋亡、誘導(dǎo)腦缺血耐受，證實(shí)了遠(yuǎn)隔器官缺血預(yù)處理對腦的保護(hù)作用。在進(jìn)一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，LIP可通過上調(diào)大鼠海馬p38 MAPK的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。但是，缺血預(yù)處理的肢體與遭受缺血打擊的大腦

4、之間相隔較遠(yuǎn)，由LIP啟動的保護(hù)性信號如何作用于腦，又通過哪些途徑上調(diào)海馬p38 MAPK的表達(dá)尚不完全清楚。趙紅崗等研究證實(shí)，LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)可部分阻斷LIP對腦缺血的保護(hù)作用，提示神經(jīng)途徑參與了LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受。有國外學(xué)者研究證實(shí)，遠(yuǎn)程雙下肢亞致死性缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)24 h內(nèi)的腦缺血耐受，這種保護(hù)作用在一定程度上可能是通過神經(jīng)源性途徑介導(dǎo)的。
　　基于以上結(jié)論，本課題的研究目的在于:①觀察切斷雙側(cè)股神經(jīng)和/或坐骨神

5、經(jīng)對肢體缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受的影響;②觀察切斷雙側(cè)股神經(jīng)和/或坐骨神經(jīng)在肢體缺血預(yù)處理腦保護(hù)中是否影響大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK的表達(dá)。通過上述研究，探討股神經(jīng)和/或坐骨神經(jīng)是否在肢體缺血預(yù)處理腦保護(hù)及上調(diào)p38 MAPK的表達(dá)中發(fā)揮作用。這些問題的解決，可為研究開發(fā)提高神經(jīng)元對缺血性損害耐受性的方法和腦缺血性疾病的預(yù)防與治療提供新思路。
　　1、股神經(jīng)和/或坐骨神經(jīng)在肢體缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受中的作用

6、r>　　99只Wistar大鼠永久凝閉雙側(cè)椎動脈后恢復(fù)兩天，隨機(jī)分為以下9組:①全腦缺血的sham組(n=11):只暴露雙側(cè)頸總動脈，不阻斷血流;②全腦缺血組(brain ischemia，BI)(n=11):夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復(fù)再灌注;③LIP+全腦缺血組(LIP+BI)(n=11):夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌注10 min、反復(fù)3次作為肢體缺血預(yù)處理后，即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min作為損傷性缺血，然后恢復(fù)再灌注;④股

7、神經(jīng)切斷(femoralnerve resection，F(xiàn)NS)+全腦缺血組(n=11):切斷雙側(cè)股神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血;⑤股神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血(FNS+LIP+BI)組(n=11):LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血;⑥坐骨神經(jīng)切斷(sciatic nerve resection，SNS)+全腦缺血組(n=11):切斷雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血;⑦坐骨神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血(SNS

8、+LIP+BI)組(n=11): LIP前切斷雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血;⑧股神經(jīng)切斷+坐骨神經(jīng)切斷+全腦缺血(FNS+SNS+BI)組(n=11):切斷雙側(cè)股神經(jīng)及雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血;⑨股神經(jīng)切斷+坐骨神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血(FNS+SNS+LIP+BI)組(n=11): LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)及雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血。以上各組大鼠分別取6只在sham或末次缺血再灌注后7d斷頭取腦

9、，冠狀切片后進(jìn)行硫董染色。低倍鏡下觀察硫堇染色的海馬組織形態(tài)，參照Kitagawa(1990)和Kato(1991)分級方法，對海馬CA1區(qū)確定組織學(xué)分級(histological grade，HG)，標(biāo)準(zhǔn)如下:0級:無神經(jīng)元死亡;級:散在神經(jīng)元死亡;Ⅱ級:成片神經(jīng)元死亡;Ⅲ級:幾乎全部神經(jīng)元死亡。高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)雙側(cè)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片雙側(cè)海馬各計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段，取平均數(shù)作為神經(jīng)

10、元密度（neuronal density, ND）。各組大鼠其余5只在sham或末次缺血再灌注后3d斷頭取腦，冠狀切片后進(jìn)行TUNEL染色計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)雙側(cè)海馬CA1區(qū)1mm區(qū)段內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，每側(cè)海馬CA1區(qū)各計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段，取其平均數(shù)。
　　硫董染色結(jié)果顯示，全腦缺血的sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊、致密，為2～3層，細(xì)胞形態(tài)完整、邊界清晰，無細(xì)胞缺失，胞核飽滿、核仁深染、清晰，無明顯的延遲性

11、神經(jīng)元死亡(delayed neuronaldeath，DND)，HG為0級，ND值為223±20.23（cells/nm，下同）。全腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)有明顯的組織學(xué)損傷，出現(xiàn)嚴(yán)重的DND，錐體細(xì)胞形態(tài)改變明顯，幾乎全部神經(jīng)元死亡或缺失，HG為Ⅲ級，ND值為46±12.52，與sham組相比，HG明顯升高(P＜0.01)，ND值明顯降低(P＜0.01)。LIP+BI組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元未見明顯損傷，僅個(gè)別細(xì)胞胞核固縮，細(xì)胞

12、排列整齊，無明顯細(xì)胞缺失，與BI組相比，HG(0～Ⅰ)明顯降低、ND值（198±19.49）明顯升高(P＜0.01)。FNS+LIP+BI組、SNS+LIP+BI組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元有明顯組織學(xué)損傷，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，成片死亡或缺失，與LIP+BI組相比，HG（Ⅰ～Ⅱ級）升高(P＜0.01)，ND值（165.83±21.33，173±13.59）明顯降低(P＜0.01)。FNS+SNS+LIP+BI組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元成

13、片死亡，出現(xiàn)嚴(yán)重的DND，錐體細(xì)胞形態(tài)改變明顯，組織學(xué)損傷嚴(yán)重，HG為Ⅱ～Ⅲ級，ND值為93±8.17，與LIP+BI組相比，HG明顯升高(P＜0.01)，ND值明顯降低(P＜0.01)。上述結(jié)果表明，肢體缺血預(yù)處理明顯減輕了大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡、發(fā)揮了腦保護(hù)作用，而分別或聯(lián)合切斷雙側(cè)股神經(jīng)和坐骨神經(jīng)均可以部分阻斷LIP的上述腦保護(hù)作用，提示神經(jīng)途徑參與了LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受。
　　TUNEL染色

14、結(jié)果顯示，腦缺血的sham組海馬CA1區(qū)偶有棕黃色深染的TUNEL陽性細(xì)胞，神經(jīng)元體積變小，核固縮，呈圓點(diǎn)狀或扇形，染色質(zhì)呈新月形或條形聚集于核周。腦缺血組海馬CA1區(qū)可見大量的TUNEL陽性細(xì)胞，與sham組相比細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P＜0.01)，提示8min的全腦缺血對大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的打擊是致命的，引起大量的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。LIP+BI組TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)與腦缺血組相比明顯減少(P＜0.01)，說明LIP明顯抑制全腦缺血

15、引起的海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)了腦缺血耐受。與LIP+BI組相比，F(xiàn)NS+LIP+BI組、SNS+LIP+BI組和FNS+SNS+LIP+BI組，海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，表明分別或聯(lián)合切斷雙側(cè)股神經(jīng)和坐骨神經(jīng)可拮抗LIP抑制凋亡的作用。
　　2、股神經(jīng)和/或坐骨神經(jīng)在肢體缺血預(yù)處理上調(diào)海馬CA1區(qū)p38 MAPK表達(dá)中的作用
　　90只Wistar大鼠永久凝閉雙側(cè)椎動脈恢復(fù)兩天后，隨機(jī)分為以下9組:①

16、全腦缺血的sham組(n=10):只暴露雙側(cè)頸總動脈，不阻斷血流;②全腦缺血組(brain ischemia，BI)(n=10):夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min后恢復(fù)再灌注;③LIP+BI組(n=10):夾閉雙側(cè)股動脈10 min、再灌注10 min、反復(fù)3次作為肢體缺血預(yù)處理后，即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min作為損傷性缺血，然后恢復(fù)再灌注;④股神經(jīng)切斷(femoral nerve resection，F(xiàn)NS)+全腦缺血組(n=10):切斷

17、雙側(cè)股神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血;⑤股神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血(FNS+LIP+BI)組(n=10):LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血。⑥坐骨神經(jīng)切斷(sciatic nerve resection，SNS)+全腦缺血組(n=10):切斷雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血;⑦坐骨神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血(SNS+LIP+BI)組(n=10):LIP前切斷雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血;⑧股神經(jīng)

18、切斷+坐骨神經(jīng)切斷+全腦缺血(FNS+SNS+BI)組(n=10):切斷雙側(cè)股神經(jīng)及雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血;⑨股神經(jīng)切斷+坐骨神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血(FNS+SNS+LIP+BI)組(n=10):LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)及雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8 min全腦缺血。以上各組大鼠在sham手術(shù)或末次缺血再灌注12h斷頭取腦，各組分別取5只用于免疫組織化學(xué)、5只用于Western blotting，檢測大鼠海馬CA1區(qū)p-

19、p38 MAPK的表達(dá)。
　　免疫組化結(jié)果顯示，全腦缺血的sham組和全腦缺血組海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK陽性表達(dá)較少，陽性細(xì)胞胞核著色，呈棕黃色，染色淺，積分光密度分別為3.37±0.12、3.30±0.03，陽性細(xì)胞總面積分別為6056.23±522.3、6106.62±458.43（μm2，下同）。LIP+BI組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元p-p38 MAPK的表達(dá)明顯增多，胞核著色加深，呈深棕黃色，其積分光密度和陽性細(xì)胞總面積

20、分別為11.90±0.27和12036.60±693.91，與BI組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明LIP能夠上調(diào)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK的表達(dá)。與LIP+BI組相比，F(xiàn)NS+LIP+BI組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中p-p38 MAPK的表達(dá)量較少，胞核染色較淺，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，其積分光密度和陽性細(xì)胞總面積分別為4.63±0.07和6561.17±301.5。SNS+LIP+BI組海馬CA1區(qū)神

21、經(jīng)元中p-p38 MAPK的表達(dá)量降低，與LIP+BI組相比，陽性細(xì)胞積分光密度（5.07±0.13）和陽性細(xì)胞總面積（6835.91±401.47）均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。FNS+SNS+LIP+BI組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中p-p38 MAPK的表達(dá)量少，胞核著色淺，陽性細(xì)胞積分光密度和總面積分別為3.15±0.22和6361.81±210.41，與LIP+BI組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分別或聯(lián)

22、合切斷雙側(cè)股神經(jīng)和坐骨神經(jīng)能阻斷LIP對腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK表達(dá)的上調(diào)作用。
　　Western blot結(jié)果顯示，全腦缺血的sham組和全腦缺血組海馬CA1區(qū)p-p38MAPK的表達(dá)量很低。LIP+BI組的p-p38MAPK的表達(dá)量明顯增加，與BI組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。FNS+LIP+BI組、SNS+LIP+BI組和FNS+SNS+LIP+BI組中p-p38MAPK的表達(dá)量較少，與LIP+BI組

23、相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。以上結(jié)果表明，LIP能夠上調(diào)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK的表達(dá)，而LIP的此種作用可被股神經(jīng)和/或坐骨神經(jīng)切斷所阻斷。
　　結(jié)論:
　　(1)切斷雙側(cè)股神經(jīng)和/或坐骨神經(jīng)可部分阻斷LIP的腦保護(hù)作用，提示LIP對腦缺血的保護(hù)作用中有神經(jīng)機(jī)制的參與。
　　(2)切斷雙側(cè)股神經(jīng)和/或坐骨神經(jīng)可以阻斷LIP抑制腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的作用。
　　(3)切斷雙側(cè)股神經(jīng)