ApoE---小鼠主動脈粥樣硬化斑塊中EMMPRIN和uPA的表達及阿托伐他汀干預的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是心血管疾病患者發(fā)生心臟事件的主要原因，其發(fā)生的主要機制為不穩(wěn)定斑塊(Vulnerable plaque)的破裂并繼發(fā)血栓，從而導致急性的血流減少或中斷。不穩(wěn)定性斑塊的主要病理特征為：薄的偏心性纖維帽，富含脂質的粥樣壞死中心，斑塊周圍大量炎癥細胞的浸潤。既往研究證實基質金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)能降解

2、纖維帽基質，使斑塊失去穩(wěn)定性，從而導致斑塊破裂。MMPs是影響易損斑塊薄纖維帽的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)降解過程的關鍵因子。由于MMPs在動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞、平滑肌細胞內高表達，并起到降解細胞外基質作用，被證實與動脈粥樣硬化、ACS發(fā)生有著密不可分的聯(lián)系。隨著研究深入，作為誘導MMPs產生及分泌的細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloprotei

3、nase inducer，EMMPRIN)被證實在人動脈粥樣硬化斑塊的血管內膜、血管平滑肌細胞以及斑塊內高表達。動脈粥樣硬化患者的旋切斑塊染色表明，在斑塊易破裂的肩部及巨噬細胞大量浸潤處有EMMPRIN的表達。不僅如此，還有研究發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN在急性心肌梗死患者體內表達增強，它刺激單核細胞/巨噬細胞表達MMP-9、平滑肌細胞表達MMP-2，而在穩(wěn)定型心絞痛患者體內無過表達。諸多研究證實MMPs及其上游因子-EMMPRIN在促進基質的

4、降解、導致ACS的發(fā)生等方面同樣起著極其重要的作用。尿激酶型纖溶酶原激活物(Urokinase-typeplasminogen activator，uPA)是纖溶酶原系統(tǒng)的重要組成部分，其致動脈粥樣硬化的作用正得到新的認識：在動脈壁局部起到促使基質降解、細胞粘附、細胞遷移增殖、細胞因子調節(jié)等作用。還可在多種細胞因子的刺激下直接參與到動脈粥樣硬化的血管重塑過程中。Quemener在研究腫瘤細胞的侵襲性過程中發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN通過刺激MM

5、P2、MMP9、uPA的表達提高了腫瘤細胞的侵襲能力。在這個研究中，EMMPRIN的過表達刺激了uPA的分泌，MMP2、MMP9的作用與其參與新生血管的形成有關。Joachim Kienast發(fā)現(xiàn)：人冠狀動脈內uPA的含量與粥樣硬化病變的存在和嚴重性相關。且有研究發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN和uPA在冠心病患者的動脈粥樣硬化斑塊中及斑塊破裂的好發(fā)部位“肩部”均有高表達。還有研究證明uPA與MMPs均受到EGF/EGFR系統(tǒng)的調控，uPA可通過誘

6、導MMPs的表達起到水解ECM的作用。那么，在人動脈粥樣硬化病變過程中，EMMRPIN、uPA兩者存在什么樣的關系，uPA是否也通過MMPs這一途徑致動脈粥樣硬化并起到粥樣斑塊去穩(wěn)定的作用，抑或EMMRPIN通過調節(jié)uPA表達的作用參與到動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展中。
　　 多項大型臨床試驗證實應用他汀類藥物可明顯減少穩(wěn)定性心絞痛及ACS患者的心血管病死亡率及全因死亡率，且不全依賴于血漿膽固醇的降低，但其中的相關機制目前尚不完全

7、清楚。阿托伐他汀(atorvastatin)是羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，作為代表性的他汀類藥物，除具有調脂作用外，亦被認為具有抑制炎癥反應、抗氧化應激、穩(wěn)定內皮功能、穩(wěn)定斑塊、促進凋亡、抑制平滑肌細胞的增生、抑制血小板的凝集等不依賴于膽固醇降低的直接和間接心血管保護作用。WOSCOPS(西蘇格蘭冠心病預防研究)、AFCAPS/TexCAPS試驗(空軍/得克薩斯州冠狀動脈粥樣硬化研究)、ASCOT LLA、4S

8、(北歐辛伐他汀生存研究)、CARE(冠心病事件復發(fā)研究)、LIPID(普伐他汀對冠心病的長期干預)等大型國際臨床實驗結果均證明他汀類藥物的使用可使致命性和非致命性心肌梗死發(fā)病率降低，心血管事件減少，總病死率降低，血管重建/CABG需求減少。
　　 本實驗以所形成病變與人類動脈粥樣硬化病理學形態(tài)極為相似的載脂蛋白E基因敲除小鼠高脂飲食飼養(yǎng)建立動脈粥樣硬化模型，在體探討EMMPRIN與uPA在動脈粥樣硬化斑塊中表達情況及阿托伐他汀干

9、預對其表達的調節(jié)作用：1、EMMPRIN與uPA是否在動脈粥樣硬化斑塊中共同高表達；2、EMMPRIN與uPA的表達是否與斑塊的不穩(wěn)定性相關，在不同的階段的斑塊中表達是否存在區(qū)別；3、阿托伐他汀的應用是否對EMMPRIN與uPA的表達存在影響，與時間及劑量是否相關。從而為動脈粥樣硬化病變及ACS的發(fā)生發(fā)展機制研究提供理論依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 1、8周齡雄性ApoE-/-小鼠62只，平均體重24g，普通飼料適應性

10、喂養(yǎng)1周后，隨機抽出6只用作備用，按照普通小鼠飼料+15％豬油+1.25%膽固醇比例配制高脂飲食飼料，余下56只鼠隨機分為早期干預(ES)組(n=28)及晚期干預(LS)組(n=28)分別飼養(yǎng)6周及10周建立動脈粥樣硬化模型。隨后均使用阿托伐他汀藥物干預，早晚干預組各隨機分為4組(n=7)，分別為普通飲食對照組(A，E)，高脂飲食對照組(B，F(xiàn))，低劑量干預組(5mg/kg.d)(C，G)，高劑量干預組(10mg/kg.d)(D，H)；

11、干預組用高低兩種劑量阿托伐他汀混懸液0.3ml/d灌胃，對照組用等量生理鹽水灌胃。藥物干預8周后處死小鼠，采集標本。
　　 2、血脂檢測：ApoE-/-小鼠處死前取血清，Olympus Au2700全自動生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。
　　 3、蘇木精-伊紅染色：取ApoE-/-小鼠主動脈制備石蠟切片，脫蠟后用蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察主動脈根部動脈粥樣硬化斑

12、塊形態(tài)。
　　 4、半定量RT-PCR：取ApoE-/-小鼠主動脈，液氮中研磨組織，RNAiso Plus提取總RNA，核酸蛋白分析儀測定RNA濃度，兩步法逆轉錄試劑盒轉錄為cDNA。所有引物均參照Gengbank提供的序列，由大連寶生物公司合成?；駿MMPRIN和uPA、β-actin進行PCR擴增的引物序列分別是：EMMPRIN：上游：5’-GCA GAG GAC ACA GGC ACT TAC-3’，下游：5’-ACA

13、GGC TCA GGA AGG AAG ATG-3’；uPA：上游：5’-CCC CAA GGT TTACTG ATG TGC TC-3’，下游：5’-GAA GTG TGA GAC CCT CGT GTA GA--3’：β-actin：上游：5’-AGA TTA CTG CTC TGG CTC CTA GC-3’，下游：5’-ACT CAT CGT ACT CCTGCT TGC T-3’。RT-PCR儀擴增目的基因后用1.5%瓊脂糖凝

14、膠電泳，凝膠成像儀分析其圖像并測得灰度值，以EMMPRIN和uPA與β-actin光密度比值表示EMMPRIN與uPAmRNA的表達水平。
　　 5、實時定量RT-PCR：總RNA提取、cDNA合成同前，基因表達用SYBR Greenl熒光定量PCR進行分析。
　　 6、蛋白提取和Western blot：取ApoE-/-小鼠主動脈，液氮中研磨后按1mg組織加入預冷的10ul裂解液(含終濃度為1mM的PMSF)裂解組織，

15、收集裂解的組織在4℃下，20000轉離心30min，使用BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度。取40μg總蛋白樣品與上樣緩沖液，混勻后100℃煮5 min，在10%SDS-PAGE中行垂直電泳(80-100V，120min)，室溫50V×120min轉樣品至PVDF膜，6.0%脫脂奶粉在4℃下溫和振蕩封閉過夜。取出膜結合相應的EMMPRIN和uPA抗體，濃度按說明書配比；內參anti-GAPDH，濃度為1:1000，室溫振蕩1h，4℃孵育過夜，

16、TBST洗膜后，結合相應的辣根過氧化物酶標二抗，濃度為1:2500)，室溫1h。用化學發(fā)光試劑(ECL)盒與PVDF膜共孵育1min后，將PVDF膜與X光片放入暗盒內曝光3min，顯影后定影。掃描膠片，用軟件分析條帶光密度值，以EMMPRIN和uPA與GAPDH條帶的吸光面積積分比值評定EMMPRIN與uPA蛋白表達水平。
　　 7.免疫組化及膠原細胞的檢測：免疫組化法使用抗體檢測巨噬細胞、平滑肌細胞。步驟如下：切片脫蠟至水，0

17、.3％H2O2甲醇處理切片，蒸餾水、PBS清洗。枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復，取出迅速冷卻，PBS清洗洗。封閉后加入對應一抗孵育。清洗后二抗孵育。PBS洗，蒸餾水洗。Harris蘇木素染核。蒸餾水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。于光鏡下觀察染色結果，結果用Image Pro Plus6.0分析軟件分析。Masson法檢測膠原成分，步驟為：切片脫蠟至水，0.3%H2O2甲醇處理切片，蒸餾水、PBS漂洗。Harris蘇木素染核，鹽酸酒精分化

18、。蒸餾水沖洗，麗春紅酸性品紅液染色，蒸餾水沖洗。1%磷鉬酸中染色，不洗，置于苯胺藍液或亮綠液。蒸餾水快速沖洗，60℃溫箱烘干，二甲苯透明，封固。于光鏡下觀察染色結果，結果用Image Pro Plus6.0分析軟件分析。
　　 結果:
　　 1、成功建立動脈粥樣硬化動物模型：ApoE-/-小鼠在高脂飲食(普通小鼠飼料+15%豬油+1.25%膽固醇)6周后，主動脈大體標本石蠟切片HE染色倒置相差纖維鏡下觀察小鼠主動脈內AS

19、斑塊形成。至10周，可見形成粥樣核心及纖維帽的顯著斑塊，斑塊內大量泡沫細胞形成和堆積，主動脈內膜增厚，向管腔突出，模型建立成功。
　　 2、ApoE-/-小鼠主動脈石蠟切片HE染色倒置相差纖維鏡下觀察結果顯示，小鼠高脂飲食飼養(yǎng)6周時相比普通飲食喂養(yǎng)小鼠所形成斑塊內泡沫細胞形成和堆積明顯增多，主動脈內膜明顯增厚，并突向管腔，斑塊穩(wěn)定性差，較易損。隨高脂飲食喂養(yǎng)時間延長，粥樣斑塊病變程度加重，斑塊不穩(wěn)定性增強，與普通飲食喂養(yǎng)小鼠相比

20、存在明顯差異，斑塊的形成早期且程度嚴重。
　　 3、ApoE-/-小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊內EMMPRIN與uPA基因及蛋白的表達：早/晚干預組高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動脈分別用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、免疫組化方法從基因、蛋白及組織三個水平檢測EMMRPIN、uPA的表達。結果顯示高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠EMMPRIN與uPA的基因及蛋白的表達與普通喂養(yǎng)對照組相比明顯增加，差別均有

21、統(tǒng)計學意義(P<0.05，基因及蛋白的表達都做了內對照)。
　　 4、阿托伐他汀干預可降低ApoE-/-小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA的表達：對使用高脂飲食建立了動脈粥樣硬化模型的小鼠，使用不同劑量的阿托伐他汀進行干預，并分別用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、免疫組化法檢測小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊內EMMPRIN與uPA的基因、蛋白及組織水平的表達；結果顯示，阿托伐他汀干預后

22、主動脈內EMMPRIN與uPA的表達與高脂組相比顯著降低，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA表達上調，該現(xiàn)象可被阿托伐他汀所阻斷。
　　 5、阿托伐他汀通過劑量依賴降低ApoE-/-小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA表達：分別使用高/低兩種劑量阿托伐他汀干預使用高脂飲食喂養(yǎng)建立動脈粥樣硬化模型的小鼠，并分別用RT-PCR、Real-Tim

23、e PCR及Western blot、免疫組化法檢測小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊內EMMPRIN和uPA基因及蛋白的表達；結果顯示，高劑量組主動脈內EMMPRIN與uPA的基因及蛋白的表達與低劑量組相比顯著降低，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ApoE-/-小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA的表達上調可被阿托伐他汀所劑量依賴型阻斷。
　　 6.uPA與EMMPRIN在ApoE-/-小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊中表達增高

24、且呈相同趨勢，使用阿托伐他汀干預后均出現(xiàn)表達的明顯下降且趨勢一致。
　　 結論:
　　 1.高脂飲食可誘導ApoE-/-小鼠主動脈內早期形成程度嚴重的粥樣硬化斑塊；
　　 2.ApoE-/-小鼠主動脈、動脈粥樣硬化斑塊中EMMPRIN與uPA出現(xiàn)過表達，其程度與斑塊的嚴重程度及不穩(wěn)定性相關。
　　 3.他汀可一定程度減輕高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊病變嚴重程度。
　　 4.他汀干