Wnt信號(hào)分子在間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)炎癥性腸上皮中的表達(dá)研究.pdf

1、第一部分
　　研究背景:炎癥性腸病(IBD)是一種反復(fù)發(fā)作，遷延不愈的慢性腸道炎癥性疾病，包括炎癥限制在大腸的潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和炎癥發(fā)生在胃腸道任何部位的克羅恩病(CD)。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在治療IBD過程中有較好的治療效果。但是在治療過程中MSCs是如何發(fā)揮作用以及哪些信號(hào)通路及信號(hào)分子在治療過程中起著重要作用，目前尚不清楚。
　　目的:主要研究間充質(zhì)干細(xì)胞在治療修復(fù)炎癥性腸病動(dòng)物模型過程中Wnt

2、/β-catenin信號(hào)通路以及相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)情況與作用。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)分組：18只健康雄性 SD大鼠購自于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，將其隨機(jī)分為3組，每組6只大鼠。3組分別是正常對(duì)照組、IBD組和MSCs治療組。同時(shí)還設(shè)有一組單純MSCs細(xì)胞組。
　　2、實(shí)驗(yàn)性IBD模型大鼠的建立：用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)通過灌腸的方法進(jìn)行制作IBD大鼠模型。
　　3、MSCs細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞移植：標(biāo)記有

3、綠色熒光蛋白（GFP）的MSCs購買于美國Cyagen Biosciences Inc.公司。用L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞傳代。將生長良好的間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml并通過尾靜脈注射方法注入IBD大鼠模型體內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞移植治療。
　　4、全基因組表達(dá)譜芯片分析及差異基因篩選：通過對(duì)大鼠受損修復(fù)大腸組織的總RNA的提取，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，其中RNA和ds-cDNA的定量及質(zhì)量保證通過NanoDr

4、op ND-1000技術(shù)。再用Axon GenePix400B基因芯片掃描儀進(jìn)行掃描，將掃描的數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入NimbleScan v2.6軟件，篩選P<0.05，F(xiàn)C>2為差異基因。根據(jù)差異基因結(jié)果分析及相關(guān)文獻(xiàn)的查找，篩選出本實(shí)驗(yàn)主要研究的差異基因。
　　5、熒光定量 PCR技術(shù)應(yīng)用于篩選出差異基因的驗(yàn)證，分析發(fā)生炎癥以及MSCs細(xì)胞移植治療后第14天和第28天時(shí)的相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)情況，并分析可能起到的作用。
　　結(jié)果:

5、r>　　1、成功建立實(shí)驗(yàn)性IBD模型大鼠：肉眼觀察可見大鼠腸壁充血發(fā)炎，并有大范圍的潰瘍形成。
　　2、MSCs細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞移植成功：MSCs細(xì)胞生長良好，并能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白。通過尾靜脈注射移植 MSCs細(xì)胞后，在顯微鏡下可觀察到 MSCs分布于IBD大鼠模型腸道炎癥部位。
　　3、通過表達(dá)譜基因芯片結(jié)果分析，得到差異表達(dá)基因有388個(gè)，其中包括191個(gè)上調(diào)基因和197個(gè)下調(diào)基因。其中與增殖分化相關(guān)的Wnt信號(hào)通路與

6、差異基因表達(dá)密切相關(guān)，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的查找，篩選出與 Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)的Wnt3a，F(xiàn)zd3，Wnt5a，Wnt11，GSK-3β,β-catenin，c-myc，cyclin D，TCF4和APC等信號(hào)分子作為本實(shí)驗(yàn)主要研究的對(duì)象。
　　4、經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在炎癥及修復(fù)過程中的表達(dá)情況：Wnt3a基因在IBD組中表達(dá)量(2.92±0.94)明顯高于正常組，而在MSCs治療組中表達(dá)量比其

7、他兩組均明顯降低。GSK-3β基因在炎癥過程中表達(dá)水平顯著減少，而在MSCs移植組中的表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平，與正常組沒有明顯差異。β-catenin基因在IBD組中的表達(dá)水平比正常組水平顯著增高，MSCs移植治療后表達(dá)水平與IBD組比較明顯下降，但與正常組水平相比無明顯差別。其他相關(guān)基因比如Fzd3、c-myc和TCF4等在炎癥發(fā)生過程中沒有明顯變化，但在細(xì)胞移植治療過程中表達(dá)量均顯著降低。
　　5、非經(jīng)典 Wnt/β-cate

8、nin信號(hào)通路在炎癥及修復(fù)過程中的表達(dá)情況：Wnt11基因在IBD組第14天時(shí)表達(dá)量較正常水平顯著下降，在第28天表達(dá)量恢復(fù)到正常水平，與正常組比較無明顯差異。當(dāng)MSCs細(xì)胞移植后Wnt11基因表達(dá)水平較IBD組和正常組均顯著降低。而 Wnt5a基因在 IBD組和正常組中沒有明顯變化，在MSCs移植后的第28天表達(dá)量較正常對(duì)照組和IBD組顯著下降。
　　結(jié)論:
　　1、通過 TNBS灌腸誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性炎癥性腸病大鼠模型成功建立，

9、可見大鼠大腸組織有潰瘍、炎癥現(xiàn)象發(fā)生。
　　2、MSCs移植到IBD大鼠模型后可觀察到MSCs能夠定植于大鼠的炎癥組織區(qū)域，并起到修復(fù)作用。
　　3、在IBD炎癥發(fā)生時(shí)，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠被Wnt3a激活，而在MSCs細(xì)胞移植修復(fù)過程中經(jīng)典信號(hào)通路相關(guān)的信號(hào)分子表達(dá)水平下降，經(jīng)典信號(hào)通路可能被抑制，從而促進(jìn)MSCs分化成為腸上皮細(xì)胞，促進(jìn)炎癥的好轉(zhuǎn)。
　　4、非經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)

10、通路相關(guān)分子Wnt11的表達(dá)水平在炎癥發(fā)生時(shí)表達(dá)下降，非經(jīng)典信號(hào)通路可能被抑制，在MSCs移植修復(fù)過程中Wnt5a和Wnt11表達(dá)水平均顯著下降，非經(jīng)典信號(hào)通路可能同樣被抑制。
　　第二部分
　　研究背景:紅細(xì)胞在體外儲(chǔ)存的過程會(huì)產(chǎn)生一系列“儲(chǔ)存損傷”，比如紅細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞膜的損傷以及生理生化等方面的變化。近期的研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮（NO）含量水平的下降與紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷有關(guān)，添加NO能改善儲(chǔ)存紅細(xì)胞的變形性。而三磷酸腺苷（A

11、TP）是紅細(xì)胞的直接供能物質(zhì)，同樣與儲(chǔ)存損傷密切相關(guān)。目前已經(jīng)成為公認(rèn)的最為重要的血液質(zhì)量指標(biāo)之一。
　　目的:研究儲(chǔ)存紅細(xì)胞在體溫環(huán)境下添加NO供體SNP后NO及ATP含量變化，以探索添加NO供體后對(duì)紅細(xì)胞儲(chǔ)存質(zhì)量的影響。
　　方法:
　　1、紅細(xì)胞儲(chǔ)存過程中NO及ATP含量檢測：采集5名健康O型獻(xiàn)血者血液樣本，制成懸浮紅細(xì)胞，分成新鮮紅細(xì)胞組和儲(chǔ)存紅細(xì)胞組。新鮮紅細(xì)胞組在采集后1h內(nèi)檢測NO及ATP含量。儲(chǔ)存紅細(xì)胞

12、組在儲(chǔ)存20天時(shí)檢測其NO及ATP含量。
　　2、儲(chǔ)存紅細(xì)胞中添加不同濃度NO供體，確定本實(shí)驗(yàn)中適合的添加濃度：紅細(xì)胞儲(chǔ)存20天時(shí)添加終濃度為1、5、25μM硝普鈉（SNP）進(jìn)行37℃孵育30min，檢測添加SNP后紅細(xì)胞中NO及ATP含量水平的變化，根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)分析確定適合的添加SNP濃度。
　　3、添加適合的SNP后放入4℃冰箱中保存不同的時(shí)間段，探索添加SNP后保存過程中NO及ATP含量變化：確定適合的添加濃度后，添加

13、SNP孵育30min后保存于4℃冰箱中在0h、1h、4h三個(gè)時(shí)間段檢測NO及ATP含量的變化，探索添加SNP后對(duì)血液質(zhì)量的影響以及可能作用的時(shí)間長度。
　　結(jié)果:
　　1、紅細(xì)胞儲(chǔ)存過程中NO及ATP含量水平明顯下降：儲(chǔ)存紅細(xì)胞中總NO（7.63±2.62 vs.15.56±2.26,P<0.05）、胞漿NO（2.21±1.68 vs.5.81±1.79,P<0.05）、結(jié)合NO（5.42±2.00 vs.9.75±2.73

14、,P<0.05）以及ATP含量水平（3.16±0.91 vs.8.10±1.21，P<0.05）均較新鮮組紅細(xì)胞水平顯著下降。
　　2、添加不同濃度SNP后，NO及ATP含量檢測結(jié)果：在儲(chǔ)存紅細(xì)胞中添加不同濃度1、5、25μM SNP后，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)添加1μM SNP的儲(chǔ)存紅細(xì)胞中NO及ATP含量未發(fā)生改變；添加5μM SNP的儲(chǔ)存紅細(xì)胞中總NO（14.15±1.76 vs.7.63±2.62,P<0.05）、胞漿NO

15、（6.10±1.95 vs.2.21±1.68,P<0.05）、結(jié)合NO（8.05±1.44 vs.5.42±2.00,P<0.05）和ATP含量（6.16±1.29 vs.3.16±0.91，P<0.05）較添加前明顯增加；添加25μM SNP的儲(chǔ)存紅細(xì)胞中NO含量顯著增加，但過高的NO能夠損傷紅細(xì)胞變形性，同時(shí) ATP含量沒有明顯變化。最終確定5μM SNP為本實(shí)驗(yàn)適合的添加濃度。
　　3、添加SNP后不同時(shí)間段的檢測結(jié)果：添

16、加5μM SNP，37℃孵育30min后0h時(shí)總NO、胞漿NO、結(jié)合NO以及ATP含量明顯增加，與新鮮組水平無明顯差別。添加后保存1h檢測NO含量與新鮮組無差別，ATP含量較新鮮組明顯增加。添加后保存4h檢測NO含量明顯下降，下降至儲(chǔ)存組水平；ATP含量恢復(fù)到新鮮組水平，但含量較儲(chǔ)存組明顯增加。
　　結(jié)論:
　　1、通過對(duì)新鮮組和儲(chǔ)存組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)20天儲(chǔ)存紅細(xì)胞中NO及ATP含量水平與新鮮組比較明顯下降。
　　

17、2、向儲(chǔ)存20天的紅細(xì)胞添加不同濃度1、5、25μM的NO供體硝普鈉（SNP），添加后在37℃孵育箱中孵育30min，發(fā)現(xiàn)添加5μM SNP能夠明顯增加儲(chǔ)存紅細(xì)胞中NO及ATP含量。
　　3、添加5μM SNP的儲(chǔ)存紅細(xì)胞在37℃孵育30min后紅細(xì)胞中NO含量在孵育后0h和1h的含量水平能夠恢復(fù)到新鮮組水平，但在4h時(shí)下降到儲(chǔ)存組含量水平。而紅細(xì)胞中ATP含量在4h內(nèi)均保持著較高的含量水平。在儲(chǔ)存紅細(xì)胞中添加5μM SNP有可能