核酸適配體的篩選方法學研究及靶向CD33核酸適配體偶聯(lián)化合物制備方法探討.pdf

1、目的:
　　本課題研究內(nèi)容分為兩大部分。第一部分;主要探討與優(yōu)化傳統(tǒng)核酸適配體（Aptamers）的篩選方法（如Protein-SELEX和Cell-SELEX），擬高速(high speed)篩選具有高親和性的靶向CD33蛋白核酸適配體，并研究其結(jié)構(gòu)對其親和性與穩(wěn)定性的影響。第二部分;主要以抗腫瘤藥物阿霉素(Dox)及不同形態(tài)的linker為研究對象，合成核酸適配體(Aptamers)與抗腫瘤藥物偶聯(lián)物(ADCs)，對比兩種釋放

2、阿霉素(Dox)方式（即二硫鍵斷裂和亞胺水解釋放Dox）對抗腫瘤作用的影響，以確定適合用來游離目標物的結(jié)合方式。
　　方法:
　　第一部分，本研究以Protein-SELEX篩選為基礎(chǔ)，主要以重組CD33抗原蛋白為靶向蛋白，篩選出與CD33特異性結(jié)合的核酸適配體（Aptamers）。其次，在Cell-SELEX篩選基礎(chǔ)上，我們進一步優(yōu)化篩選條件，縮短篩選時間和提高親和力。研究通過以HEK-293T細胞表達CD33蛋白為CD3

3、3+陽性細胞，HEK-293T細胞為CD33-陰性細胞，依次優(yōu)化和探索核酸適配體的篩選效率及親和性。斑點雜交法主要用于檢測篩選所得的DNA配基與CD33蛋白分子的親和性;Western Blot及免疫熒光法用于驗證細胞中CD33蛋白的表達及膜細胞定位狀況;流式細胞術(shù)法檢測每輪篩選后所得的DNA配基與CD33+陽性細胞（如HL60或CD33+過表達HEK-293T細胞）的結(jié)合能力。計算機模擬分子間對接(Docking)方法用于計算并模擬C

4、D33蛋白與核酸適配體的三維結(jié)構(gòu)。第二部分，探討偶聯(lián)藥物與適配體的合成及條件摸索，解決藥物與適配體之間的間接化合物SPDP(Linker)最佳反應(yīng)條件;如以SPDP或SPDP-hydrazine連接抗腫瘤藥物阿霉素(Dox)的反應(yīng)基團酰胺鍵和碳氮雙鍵，經(jīng)HPLC、LC-MS和1HNMR檢測，確認Dox與SPDPⅠ及SPDPⅡ是否成功連接為Dox-SPDPⅠ與Dox-SPDPⅡ的形態(tài);MTT與流式細胞術(shù)檢測Dox-SPDP1及Dox-SP

5、DPⅡ的抗腫瘤作用，判別抗腫瘤藥物Dox連接Linker。
　　結(jié)果:
　　第一部分，基于經(jīng)典的Protein-SELEX方法，我們篩選得到能夠特異性結(jié)合CD33陽性細胞的核酸適配體A88（耗時近半年）。然而，我們優(yōu)化的傳統(tǒng)核酸適配體Cell-SELEX篩選方法即Smart Cell-SELEX篩選得到核酸適配體S30（耗時9小時），并且穩(wěn)定性高于經(jīng)典Protein-SELEX方法篩選出的適配體，解離平衡常數(shù)Kd值均較小。流

6、式細胞術(shù)，Western Blot和免疫熒光結(jié)果顯示，Smart Cell-SELEX篩選得到核酸適配體S30特異性結(jié)合CD33陽性細胞，而且S30的進一步剪切體C2和NC2能夠結(jié)合CD33抗原。第二部分:HPLC、1HNMR和LC-MS結(jié)果顯示，抗腫瘤藥物Dox與Linker即SPDPⅠ與SPDPⅡ成功連接，形成Dox-SPDPⅠ與Dox-SPDPⅡ復(fù)合體。MTT與流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，Dox-SPDP1的抗腫瘤作用明顯降低，而Dox-

7、SPDPⅡ略有降低，提示藥物連接Linker會對藥物本身的活性有影響。
　　結(jié)論:
　　第一部分:與傳統(tǒng)篩選技術(shù)相比，新的Smart Cell-SELEX篩選技術(shù)可以將篩選時間縮短數(shù)十倍，在有效去除非特異性結(jié)合的DNA配基的基礎(chǔ)上快速篩選出親和性極高的核酸適配體。核酸適配體的親和性與其結(jié)構(gòu)中的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，但其穩(wěn)定性則由整個序列決定。第二部分:與運用酰胺鍵連接的Dox-SPDPⅠ相比，以碳氮雙鍵偶聯(lián)合成的Dox-SPDPⅡ在