血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)936C-T基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　1.研究中國漢族人群中VEGF3'-UTR區(qū)936C→T基因突變狀況。
　　2.探究VEGF936C/T基因多態(tài)性和糖尿病視網(wǎng)膜病病變的相關(guān)性。
　　研究對(duì)象與方法:
　?。ㄒ唬┭芯繉?duì)象
　　1、按照1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取2010年12月至2013年12月期間經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診的2型糖尿病患者，共210例，其中，男112例，女98例，選取同期泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢者120

2、例，其中，男56例，女64例，選擇對(duì)象均是中國漢族人，彼此間無任何血緣關(guān)系，無冠心病、腦梗死病史，無慢性心、腎功能不全病史，無慢性肺病史。
　　2、病例分組
　　1)健康對(duì)照組(NC):入選的120例均為OGTT正常的健康體檢者，其中，男性55例，女性65例，平均年齡(59.64±8.94)歲。
　　2)單純2型糖尿病組（DM組）:入選的52例患者中，男性28例，女性24例，平均年齡(61.53±10.42)歲，病程（

3、61.53±10.42）年。
　　3)非增殖性視網(wǎng)膜病變組(NPDR組):入選的78例患者中，男性38例，女性32例，平均年齡（60.86±11.38）歲，病程（9.67±4.61）年。
　　4)增殖性視網(wǎng)膜病變組(PDR組):入選的80例患者中，男性42例，女性38例，平均（59.94±9.91）歲，病程（9.35±4.53）年。
　?。ǘ┭芯糠椒?br>　　1.臨床資料采集、標(biāo)本的留集、保存
　　1)詳細(xì)詢

4、問所有受試者的病史并體檢，記錄年齡、性別，測(cè)身高、體重、血壓;測(cè)血壓:坐位休息30分鐘，用臺(tái)式水銀血壓計(jì)測(cè)量右上臂的血壓3次，取平均值。絕對(duì)空腹?fàn)顩r下準(zhǔn)確測(cè)量身高、體重。體重指數(shù)(BMI)=體重(Kg)/身高(m)2。檢查尿常規(guī)、腹部B超、心電圖，行眼底檢查或眼底造影，檢測(cè)神經(jīng)傳導(dǎo)速度。
　　2)采用葡萄糖氧化酶法（草酸鉀氧化鈉抗凝:2mg/mL血液）檢測(cè)受試者的空腹及餐后2h血糖，低壓液相層析柱法(EDTA抗凝全血，EDTA:血

5、量=1.5mg/mL)檢測(cè)HbA1c，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血脂、肝、腎功，放射免疫法測(cè)定血漿胰島素或C肽，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定尿AER;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linkedimmunosorbentassay, ELISA)檢測(cè)血清中VECF水平（試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司），嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
　　2.將EDTA抗凝全血2ml(EDTA:血量=1.5mg/mL)分離去除血漿后保存于-20℃的冰箱中

6、，用于抽提基因組DNA。
　　3.采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片斷長度多態(tài)性（PCR-RFLP）來測(cè)定VEGF936C/T基因多態(tài)性。
　　4.基因組DNA的提取、保存:取EDTA抗凝血100uL，采用試劑盒法提取外周血白細(xì)胞的DNA，用紫外分光光度法測(cè)定DNA的濃度、純度，抽提后的基因組DNA用TE溶解后，于-80℃長期凍存。
　　5.目的基因片段的擴(kuò)增:用外周血白細(xì)胞的基因組DNA為模板來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μl的反應(yīng)

7、體系中約含400ng的基因組DNA，上、下游引物各1.0uL（10Pmmol/ul），TaqDNA聚合酶2U，dNTP4ul（2.5mmol/uL），與Taq酶相對(duì)應(yīng)的10xPCR Buffer5μl，余用蒸餾水補(bǔ)足。在熱循環(huán)儀上進(jìn)行反應(yīng):95℃預(yù)變性5min后接著94℃變性30s，68℃退火30s后接著72℃延伸1min，重復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后在72℃延伸10min。
　　6.限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測(cè):當(dāng)凝膠電

8、泳證實(shí)PCR擴(kuò)增成功，就取PCR產(chǎn)物10μL，加入限制性內(nèi)切酶NlaⅢ和相應(yīng)酶解反應(yīng)緩沖液在37℃孵3小時(shí)后，取酶切產(chǎn)物10μL行4％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀測(cè)基因型（CC型:208bP; CT型:208bP,122bP,86bP;T T型:122bP,86bP），攝片計(jì)數(shù)。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
　　采用SPSS13.0處理所有數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示正態(tài)分布資回歸進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　

9、1.VEGF基因936C/T多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果
　　C等位基因在未發(fā)生突變時(shí)為純合型（C936C型），沒有限制性內(nèi)切酶NlaⅢ的酶切位點(diǎn)，瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果只有1條208bP片段，等位基因T如是純合型(T936T型)，兩條同源染色體上同時(shí)具有了限制性內(nèi)切酶NlaⅢ的酶切位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生122bP和86bP2條片斷，而VEGF C936T雜合型（CT型）則同時(shí)具有3條片段，分別是208bP、122bP、86bP。（見圖2，圖3）。

10、
　　2.各組間VEGF基因型和等位基因頻率比較
　　NC組、DM組、NPDR組、PDR組都有C、T兩種等位基因和CC、CT、TT三種基因型，分布特點(diǎn)符合hardy-weinberg平衡。各組的CC基因型頻率分別是46.69％、50.02％、68.77％、69.53％，C等位基因頻率分別是67.52％、64.50％、81.27％、81.73％。在NPDR組中，CC基因型和C等位基因頻率明顯高于NC組(x2=9.934，x2=

11、4.899，P＜0.01，P＜0.05)及DM組(x2=7.490，x2=4.448，P＜0.01，P＜0.05); PDR組CC基因型和C等位基因頻率明顯高于健康對(duì)照組(x2=10.895，x2=5.714，P＜0.01，P＜0.05)及單純糖尿病組(x2=8.333，x2=5.227，P＜0.01，P＜0.05); CT基因型于NC組、T2DM組、NPDR組、PDR組分布頻率分別為:41.69％、36.98％、25.02％、24.4

12、1％，T等位基因頻率分別是:32.52％、31.54％、18.77％、18.31％。NPDR組CT基因型和T等位基因頻率明顯低于NC組(2=6.486，x2=4.899，P＜0.05)和DM組(x2=4.366，x2=4.448，P＜0.05); PDR組CT基因型頻率和T等位基因頻率低于NC組(x2=7.327，x2=5.714，P＜0.01，P＜0.05)及DM組(x2=3.986，x2=5.227，P＜0.05)。進(jìn)行TT基因型頻

13、率的組間比較時(shí)，因其突變率比較低，各組之間均沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，于是參照Peter Kripple(5)的統(tǒng)計(jì)分析法，將攜帶T等位基因的基因型（即CT基因型和TT基因型）歸為一組進(jìn)行分析（簡稱為CT+TT型），其分布頻率于NC組、DM組、NPDR組、PDR組分別是53.35％、50.02％、31.27％、30.51％，NPDR組的CT+TT型基因型頻率明顯低于NC組及DM組(2=9.934，x2=7.490， P＜0.01)，PDR組C

14、T+TT型基因型明顯低于NC組及DM組（x2=10.895和x2=8.333，P＜0.01）。然而各種基因型分布頻率及等位基因分布頻率在NC組、DM組之間，NPDR組、PDR組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見表1）。
　　將不同基因型組間臨床指標(biāo)進(jìn)行比較:對(duì)于DM患者而言，CC組、CT組、TT組三個(gè)不同基因型之間在性別構(gòu)成比、年齡、病程、血壓水平、BMI、HbA1c、高密度脂蛋白(HDL-c)水平等方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0

15、.05）。CC基因型和CT基因型、TT基因型比較發(fā)現(xiàn)，:CC基因型在血糖水平、甘油三酯(TG)水平、總膽固醇(Totalcholesterol，TC)水平、低密度脂蛋白水平(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和VEGF表達(dá)水平等方面明顯升高，C肽水平明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。DM患者CC基因型攜帶者VEGF的表達(dá)水平最高，TT基因攜帶者VEGF的表達(dá)水平最低(P＜0.05)

16、（見表2）。
　　T2DM三個(gè)亞組之間的臨床、生化指標(biāo)比較
　　DM組、NPDR組、PDR組之間在性別構(gòu)成比、年齡、病程、血壓、血脂、BMI及HbA1c水平等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而單就C肽水平而言，NPDR組比DM組低，PDR組低于NPDR組和DM組(P＜0.05)。
　　4.不同基因型組之間的DR發(fā)生率比較
　　在T2DM中，CC基因型組、CT基因型組、TT基因型組的DR發(fā)生率是70.91％、54

17、.07％、45.47％。CC基因型組的DR發(fā)生率明顯高于CT基因型組(x2=6.615，P＜0.05)及TT基因型組(x2=13.875，P＜0.01)，而CT基因型組與TT基因型組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=1.620，P＞0.05）。
　　5.導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病的多重危險(xiǎn)因素分析
　　以有、無DR為因變量，以多元Logistic回歸分析多因素對(duì)DR的影響，結(jié)果顯示:VEGF基因多態(tài)性（即發(fā)生了C/T突變）與DR呈負(fù)相

18、關(guān)(β=-1.027，OR=0.343，P=0.006，CI:0.157-0.723)。VEGF濃度、HbA1c水平、LDL-C水平進(jìn)入回歸方程，OR值均大于1，為DR發(fā)病的危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論:
　　1、VEGF936C等位基因可能是中國漢族人2型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變發(fā)病危險(xiǎn)性遺傳標(biāo)志。
　　2、VEGF936C/T基因多態(tài)性對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展可能起著重要作用。
　　3、VEGF936T等位基因可能