ADAM17介導的CD163表達調(diào)控對PRRSV感染的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一。根據(jù)核酸序列的差異，PRRSV被劃分為歐洲型和美洲型毒株。2006年5月以來，我國暴發(fā)的被稱為“高熱綜合癥”的豬病，即為變異的美洲型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）所致。
　　豬肺泡巨噬細胞(PAM)是PRRSV入侵豬體

2、的靶細胞，已發(fā)現(xiàn)在PAM上存在三種主要的PRRSV細胞受體:硫酸乙酰肝素(HS)、唾液酸粘附素(Sn)和清道夫受體CD163。HS的作用是吸附PRRSV到細胞表面，Sn可以加強吸附作用并介導PRRSV內(nèi)吞進入胞內(nèi)，CD163則是隨PRRSV一同進入胞內(nèi)介導病毒的脫衣殼和病毒基因組的釋放。近年研究發(fā)現(xiàn)，將豬源CD163分子轉(zhuǎn)染至PRRSV非允許細胞，使得細胞穩(wěn)定表達CD163蛋白后就成為PRRSV允許細胞，能夠成功感染增殖PRRSV，而其

3、他兩種受體則不能，說明CD163在病毒感染細胞過程中至關重要。
　　作為清道夫受體超家族的成員，CD163參與機體對異物的免疫應答并參與炎癥反應，其在細胞表面的表達受多種因素的影響，其中去整合素金屬蛋白酶ADAM17已被證實能夠介導人源CD163的剪切調(diào)控，從而調(diào)節(jié)炎癥反應。但是ADAM17能否介導豬源CD163的剪切調(diào)控從而影響病毒的入侵還不得而知，因此本研究闡釋了ADAM17介導CD163的表達調(diào)控機制及其對PRRSV感染的影

4、響。
　　首先，從PAM細胞中擴增了豬源CD163基因，克隆至真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-CD163，在測序正確后將其轉(zhuǎn)染HEK293細胞，通過流式細胞術和G418加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達CD163的HEK293/CD163細胞系;病毒感染實驗表明PRRSV能夠感染HEK293/CD163細胞系，為研究病毒的體外感染奠定了基礎。
　　其次，通過抑制劑、激活劑、siRNA基因干擾和基因過表達等方法來抑制或者增強PAM和HEK2

5、93/CD163細胞的ADAM17表達水平或活性，檢測ADAM17對豬源CD163的剪切能力。研究結果發(fā)現(xiàn)，當ADAM17表達下調(diào)或者活性受到抑制時，細胞表面CD163的表達水平升高;當ADAM17表達上調(diào)或者被激活時，細胞表面CD163的表達水平降低，說明ADAM17介導豬源CD163的剪切調(diào)控。
　　最后，在HEK293/CD163細胞系和PAM進行接毒實驗，測定ADAM17介導的CD163表達對PRRSV感染的影響。實驗結果

6、發(fā)現(xiàn)，當用ADAM17抑制劑抑制ADAM17活性或者通過siRNA基因干擾下調(diào)ADAM17表達時，病毒感染量增多;當用LPS激活ADAM17活性或通過基因過表達提高ADAM17表達時，病毒感染量減少。上述研究發(fā)現(xiàn)表明ADAM17通過調(diào)控細胞表面豬源CD163表達水平從而影響PRRSV入侵細胞的能力。
　　總之，本研究通過流式細胞術和G418加壓篩選方法獲得了穩(wěn)定表達CD163的HEK293/CD163細胞系，并通過間接免疫熒光發(fā)鑒