穩(wěn)定表達(dá)豬CD163蛋白的HEK-293細(xì)胞系的建立和鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,其免疫機(jī)理非常復(fù)雜,并能利用多種策略逃避機(jī)體的免疫應(yīng)答,現(xiàn)階段還缺乏切實(shí)有效的防治手段。病毒受體是被病毒利用的宿主細(xì)胞表面分子復(fù)合物,它們能介導(dǎo)病毒順利進(jìn)入胞內(nèi)。研究病毒受體能夠更深層次的揭示病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制,從而為制定有效的病毒防制措施提供新的思路。
　　 豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PR

2、RSV)入侵豬體的靶細(xì)胞,已發(fā)現(xiàn)在PAM上存在三種主要的PRRSV細(xì)胞受體:硫酸乙酰肝素(HS)、唾液酸粘附素(Sn)、CD163分子。HS的作用是吸附PRRSV到細(xì)胞表面,Sn可以加強(qiáng)吸附作用并介導(dǎo)PRRSV內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi),CD163則是隨PRRSV一同進(jìn)入胞內(nèi)介導(dǎo)病毒的脫衣殼和病毒基因組的釋放。近年研究發(fā)現(xiàn),將CD163分子轉(zhuǎn)染進(jìn)入PRRSV非允許細(xì)胞,該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CD163蛋白后就能夠成功感染增殖PRRSV,成為PRRSV允許細(xì)胞

3、。鑒于此,本研究從PAM細(xì)胞中克隆了豬CD163基因,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-pCD163,將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK-293細(xì)胞,用G418加壓篩選,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD163蛋白的HEK-293-pCD163細(xì)胞系。主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面:
　　 1.豬CD163基因的克隆、序列分析及真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-pCD163的構(gòu)建
　　 根據(jù)GenBank上報(bào)道的豬CD163基因序列(EU01622

4、6.1)設(shè)計(jì)引物pCD163-F和pCD163-R,以提取的PAM細(xì)胞總RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增得到豬CD163完整編碼區(qū)cDNA序列,并將其克隆至pGEM-T easy載體。測(cè)序結(jié)果顯示,克隆得到的序列全長(zhǎng)3348bp,編碼1115個(gè)氨基酸,該序列與GenBank中的參考序列同源性高達(dá)99.7％,關(guān)鍵作用區(qū)域SRCR5結(jié)構(gòu)域氨基酸序列同源性為100％。在證實(shí)序列正確后用BamHI和XhoI酶切連接到真核表達(dá)載體pCDNA3.1/

5、V5-His B上,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-pCD163。
　　 2.穩(wěn)定表達(dá)豬CD163蛋白的HEK-293-pCD163細(xì)胞系的建立
　　 將獲得的表達(dá)豬CD163蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/V5-pCD163,轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,用G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)豬CD163蛋白的293細(xì)胞系。并采用RT-PCR、免疫熒光和Western Blot方法證實(shí)了豬CD163蛋白在所構(gòu)建的細(xì)胞系中的穩(wěn)

6、定表達(dá)。
　　 3.穩(wěn)定表達(dá)豬CD163蛋白的HEK-293-pCD163細(xì)胞系感染PRRSV的鑒定
　　 用PRRSV WUH3毒株感染建立的HEK-293細(xì)胞系,可觀察到明顯的細(xì)胞病變,并主要表現(xiàn)為細(xì)胞聚集、圓縮、細(xì)胞間出現(xiàn)空洞,最后細(xì)胞脫落、裂解。RT-PCR擴(kuò)增可獲得PRRSV的特異性基因、免疫熒光和Western Blot均可檢測(cè)到病毒蛋白的表達(dá),而未轉(zhuǎn)染豬CD163的HEK-293陰性細(xì)胞檢測(cè)均為陰性,說(shuō)明構(gòu)

7、建的細(xì)胞系確實(shí)能感染PRRSV,并允許PRRSV在其內(nèi)增殖。
　　 4.PRRSV感染HEK-293-pCD163細(xì)胞系和Marc-145細(xì)胞的增殖曲線測(cè)定和比較
　　 用相同劑量的PRRSV WUH3感染HEK-293-pCD163細(xì)胞系和Marc-145細(xì)胞系,于感染后不同時(shí)間收樣,測(cè)定 TCID50,并繪制增殖曲線。PRRSV WUH3株在兩種細(xì)胞中的增殖曲線非常相似,但病毒在HEK-293-pCD163中的增殖滴