日本血吸蟲主要蟲卵抗原Sjp40的功能研究.pdf

1、本文以日本血吸蟲蟲卵主要抗原Sjp40(Major eggantigen of Schistosomajaponicum，Sjp40)作為研究靶標分子，建立日本血吸蟲感染新西蘭白兔和BALB/c小鼠模型，一方面利用RNA干擾技術初步研究該分子對剛完成雌雄合抱處于配子發(fā)生期的感染后第19天(19 days post-infection，19dpi)組雌雄蟲合抱的影響及對完全性成熟處于產卵高峰期的45 dpi組雌蟲產卵量的影響這兩方面的生物

2、學功能;另一方面取未成熟蟲卵沉積但尚未發(fā)生肉芽腫病變的29 dpi新西蘭白兔肝臟組織以及大量成熟蟲卵聚集并發(fā)生廣泛肉芽腫急性病變期的45 dpi肝臟組織進行Sjp40的轉錄水平表達量測定及免疫熒光定位，并進行了初步的轉錄組學分析，為解析Sjp40在日本血吸蟲病肉芽腫病變的發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制奠定基礎。
　　一、日本血吸蟲雌雄蟲Sjp40的siRNA干擾及其初步功能研究
　　目的：
　　研究日本血吸蟲Sjp40基因

3、的體外RNA干擾效應;初步觀察Sjp40基因干擾后對處于配子發(fā)生期（19 dpi組）的雌雄蟲合抱率及大量產卵期（45 dpi組）的雌蟲產卵量的影響。
　　方法：
　　1.利用http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/網站設計、篩選3對針對Sjp40基因編碼區(qū)(CDS)的siRNA序列，陰性對照選用通用siRNA對照，所有siRNA標記FAM熒光。
　　2.

4、日本血吸蟲尾蚴（湖南株）自野生型陽性釘螺逸出，采用貼片法經腹部感染新西蘭白兔，于感染后第19d(19 dpi)、29 d(29 dpi)、34 d(34 dpi)和45 d(45 dpi)剖殺，經門靜脈灌注收集成蟲。
　　3.成蟲經PBS(pH7.4)沖洗3次后轉入RPMI1640完全培養(yǎng)基，置5％ CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　4.收集19 dpi、29 dpi、34 dpi和45 dpi以及培養(yǎng)各天數的雌雄蟲，備提取總

5、RNA。
　　5.浸泡法轉染終濃度為200 nmol/L的siRNA40至19 dpi組雌雄合抱日本血吸蟲成蟲，同步設立陰性對照和空白對照。5％ CO2，37℃，干擾3d、5d后，雌雄蟲分開收集，PBS洗滌3次，備提取RNA。同步觀察并統(tǒng)計RNA干擾5d后雌雄蟲合抱情況。
　　6.電穿孔法轉染終濃度為200 nmol/L的siRNA40至45 dpi日本血吸蟲雌雄合抱成蟲，同步設立陰性對照和空白對照。RNA干擾48 h后雌雄

6、蟲體分開收集，經PBS(pH7.4)洗滌3次，備提取總RNA。同步在顯微鏡下觀察并比較各組產卵量。
　　7.按Trizol試劑說明書提取日本血吸蟲雌蟲/雄蟲總RNA，經DNaseⅠ消化，逆轉錄成cDNA。qRT-PCR檢測Sjp40基因mRNA的表達情況。
　　結果：
　　1.日本血吸蟲雌雄合抱后的發(fā)育進程中，雄蟲Sjp40基因的轉錄水平在本研究檢測各點中呈穩(wěn)定性低表達;雌蟲Sjp40基因的轉錄水平在本研究檢測各點中波

7、動較大，主要表現(xiàn)在19 dpi雌雄合抱成蟲體外培養(yǎng)第2d和第3d時，雌蟲Sjp40基因的轉錄水平處于和雄蟲同樣的較低水平，而在培養(yǎng)的第5d和第9dSjp40基因的轉錄水平顯著增加，29 dpi組、34 dpi組和45 dpi組雌蟲Sjp40基因的轉錄水平均顯著高于雄蟲，且在此較高水平上有一定波動。
　　2.浸泡法遞送siRNA干擾19 dpi組雌雄合抱成蟲中Sjp40 mRNA表達，干擾效應呈現(xiàn)性別差異:以陰性對照組為基線，雌蟲S

8、jp40 mRNA水平在RNA干擾后的第3d無顯著下降，第5d下降～60％;而雄蟲Sjp40 mRNA水平在RNA干擾后的第3d和第5d均未出現(xiàn)顯著下降。siRNA40干擾組、陰性對照組和空白對照組間的雌雄合抱率在干擾后第5d無顯著性差異。
　　3.電穿孔法遞送siRNA干擾45 dpi雌雄合抱成蟲中Sjp40 mRNA表達，干擾效應亦呈現(xiàn)性別差異:以陰性對照組為基線，雌蟲Sjp40 mRNA水平在RNA干擾48 h后下降～55％

9、;而雄蟲Sjp40 mRNA水平變化在RNA干擾前后無顯著性差異。顯微鏡下初步觀察到:RNA干擾48 h后，與陰性對照組相比，siRNA40實驗組的雌蟲產卵量明顯減少。
　　4.日本血吸蟲雌蟲/雄蟲各20條的Sjp40基因克隆測序結果顯示:Sjp40基因CDS區(qū)高度保守，一致性為100％。
　　5.參照模式生物秀麗隱桿線蟲，日本血吸蟲所具有的RNAi效應器成分（小RNA生物合成，dsRNA攝入、擴散，放大效應蛋白，Argon

10、autes和RISC，RNAi抑制蛋白，核RNAi效應器）種類齊全，但每類RNAi效應器的數量減少。
　　結論：
　　1.日本血吸蟲雌蟲Sjp40轉錄水平在19 dpi雌雄合抱成蟲體外培養(yǎng)第5d開始迅速增加，其后各檢測點中一直處于高表達，且顯著高于雄蟲Sjp40轉錄水平。在siRNA40成功降低45 dpi組雌蟲Sjp40表達后，初步觀察到雌蟲產卵量明顯減少，提示雌蟲Sjp40基因與雌蟲產卵密切相關。
　　2.siRN

11、A40干擾配子發(fā)生期（19 dpi組）雌蟲Sjp40基因后，初步發(fā)現(xiàn)雌蟲Sjp40與雌雄合抱無明顯相關性。
　　3.RNA干擾19 dpi組和45 dpi組雌雄合抱成蟲，雌、雄蟲的Sjp40 RNA干擾效應均存在明顯的性別差異。
　　4.Sjp40 RNA干擾效應性別差異的發(fā)生與Sjp40基因水平性別多態(tài)性無關。二日本血吸蟲感染動物模型肝臟肉芽腫病變進程Sjp40表達與免疫
　　二、定位及其初步組學分析
　　目的

12、：
　　觀察Sjp40在感染新西蘭白兔肝臟沉積蟲卵及其肉芽腫病變形成中的表達情況及其免疫定位;對日本血吸蟲感染動物模型肉芽腫病變進程中的肝臟組織進行初步組學分析。
　　方法：
　　1.日本血吸蟲尾蚴（湖南株）自野生陽性釘螺逸出，采用貼片法經腹部感染新西蘭白兔和BALB/c小鼠，于感染后第29 d和45 d剖殺，收集未感染組、29dpi組和45 dpi組肝臟，未感染肝臟作為空白對照。
　　2.液氮快速研磨上述各期新

13、西蘭白兔和BALB/c小鼠肝臟成粉末狀后，分別加入Trizol，按TRIzol法提取各期肝臟總RNA，經DNaseⅠ消化，逆轉錄成cDNA。RT-qPCR檢測各期兔肝臟中Sjp40基因mRNA的表達。各期BALB/c小鼠肝臟RNA送公司進行轉錄組測序;
　　3.同步提取各期新西蘭白兔肝臟可溶性總蛋白(total soluble protein，TSP)。以硫酸銨鹽析法和Protein G免疫親和柱層析法純化抗Sjp40-McAb9

14、G7（檢測抗體）和抗弓形蟲tSAG1-McAb Y3A8（陰性對照抗體），Western-blot檢測Sjp40蛋白的表達。
　　4.制備各期新西蘭白兔肝臟石蠟切片，HE染色觀察肝臟中蟲卵肉芽腫的形成與發(fā)展，進一步以間接免疫熒光技術進行Sjp40在肝臟沉積蟲卵及肉芽腫組織中的定位。
　　結果：
　　1.日本血吸蟲感染兔呈急性肝肉芽腫病變期的45 dpi肝臟沉積蟲卵中Sjp40mRNA水平顯著高于29 dpi尚未形成蟲卵

15、肉芽腫結節(jié)的肝臟沉積的未成熟蟲卵(P＜0.05)。
　　2.抗Sjp40-McAb9G7特異性檢測到Sjp40蛋白在29 dpi和45 dpi新西蘭白兔肝臟中的表達。
　　3.HE染色片觀察顯示29 dpi新西蘭白兔肝臟中蟲卵極少，且皆為未成熟蟲卵，尚未見蟲卵肉芽腫形成，但肝臟已有輕微病變;45 dpi新西蘭白兔肝臟中則顯示有成熟蟲卵大量成簇沉著，蟲卵肉芽腫廣泛分布。
　　4.間接免疫熒光結果顯示:Sjp40在29 d

16、pi新西蘭白兔肝臟中定位于未成熟蟲卵內，而45 dpi，可見感染新西蘭白兔肝臟中沉積的大量成簇內含毛蚴的成熟蟲卵及其周圍肉芽腫組織均有明顯熒光。
　　5.轉錄組學初步結果顯示:29 dpi BALB/c小鼠肝臟比對到小鼠基因組((http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html＃mouse))和日本血吸蟲基因組((http://lifecenter.sgst.cn/schistosoma/

17、cn/schdownload.do))的mapped reads分別為105，021，590(91.47％)和43，117(1.5％)條。測序共獲得日本血吸蟲已知轉錄本為4238個，新轉錄本為221個。其中測序深度大于10且表達量大于500的日本血吸蟲已知轉錄本為10個，其中Sjp40表達量居首位。
　　6.統(tǒng)計學處理，用IBM SPSS19.0統(tǒng)計學軟件分析，29 dpi組和45 dpi組兩組兔肝臟沉積蟲卵間Sjp40的mRNA

18、表達差異采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.Sjp40在日本血吸蟲感染兔肝臟中的表達量隨蟲卵發(fā)育成熟而顯著增加，并由蟲卵擴散至其周圍肉芽腫組織，提示該分子在血吸蟲肉芽腫的形成與發(fā)展過程中具有重要作用。
　　2.29 dpi BALB/c小鼠肝臟轉錄組學初步分析結果顯示，Sjp40在測序深度大于10且表達量大于500的轉錄本中呈最高量表達，進一步提示Sjp40應在29 dpiBA