牛黃對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胃癌是常見的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中排名第四。許多患者被查出胃癌時(shí)已處于中晚期，喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)。此時(shí)，以化療為主的綜合治療成為首選。近年來(lái)多種臨床新藥的應(yīng)用，為中、晚期胃癌的臨床治療提供了更多的可能，如5-氟尿嘧啶(5-FU)和順鉑(CDDP)等。然而，化療藥物具有治療效果的同時(shí)亦有副作用，如粒細(xì)胞減少，靜脈滴注持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)導(dǎo)致的靜脈炎、靜脈置管并發(fā)癥等，使胃癌患者依從性差，近年來(lái)，中藥作為一種輔助治療性藥物越來(lái)越受到人們的青瞇。

2、
　　牛黃，又名西黃、犀黃。具有清熱解毒、抗炎、利膽、抗氧化和清除自由基和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)等作用，常用于咽喉腫痛、潰爛、口舌生瘡。也可治療一切癰疽疔毒之癥，如用于治療乳癌、瘰疬、癰毒等癥。新近研究發(fā)現(xiàn)牛黃具有抑制病毒復(fù)制、消炎、利膽、恢復(fù)肝功能、提高機(jī)體免疫力及抗癌的作用。研究表明:將牛黃作用于人肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)癌細(xì)胞調(diào)亡，并可能還有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。這為牛黃在惡性腫瘤的治療方面的研究和應(yīng)用開拓了新的思路。

3、迄今，未見牛黃在胃癌中的研究。因此，本研究擬用牛黃干預(yù)人胃癌BGC-823細(xì)胞株，觀察牛黃對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制增值、誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，并用牛黃聯(lián)合5-FU和CDDP誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用，以期待為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:探討牛黃對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡效應(yīng);研究牛黃聯(lián)合5-FU和CDDP對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡的協(xié)同作用。
　　方法:用不同濃度的牛黃處理胃癌BG

4、C-823細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化、通過四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況，Annexin-V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33343染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡;單獨(dú)用一定濃度的牛黃、5-FU、CDDP作用 BGC-823細(xì)胞，再用一定濃度的牛黃、5-FU和CDDP聯(lián)合作用BGC-823細(xì)胞，通過四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況，Annexin-V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、Hoec

5、hst33343染色、DNA凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。
　　結(jié)果:
　　1.倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，BGC-823細(xì)胞經(jīng)不同濃度的牛黃作用24h后細(xì)胞數(shù)量明顯減少、大小不一、細(xì)胞間隙增大，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，隨著牛黃濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)變圓，體積縮小，折光度減弱，細(xì)胞脫落明顯，碎片增多。
　　2.MTT法檢測(cè)不同濃度牛黃作用BGC-823細(xì)胞24h、48h、72h后，牛黃各個(gè)濃度組的生長(zhǎng)抑制率明顯

6、高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在同一藥物濃度下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MTT法檢測(cè)牛黃聯(lián)合5-FU、CDDP對(duì)BGC-823細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BGC-823細(xì)胞經(jīng)5-FU（100μg/mL）加牛黃(400μg/mL)和CDDP（50μg/mL）聯(lián)合作用48小時(shí)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為0.471±0.047;而空白對(duì)照組和單獨(dú)使用牛黃、5-FU、CDDP以及5-

7、FU聯(lián)合CDDP組作用48小時(shí)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為0±0、0.243±0.09、0.25±0.039、0.258±0.046、0.366±0.045。各用藥組與對(duì)照組相比較，差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而各單獨(dú)用藥組間相比較，組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，但聯(lián)合用藥組與各組相比較，差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5-FU+牛黃+CDDP組與5-FU+CDDP組相比較，差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

8、r>　　3.不同濃度牛黃作用BGC-823細(xì)胞24h、48h、72h后，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明100μg/mL牛黃作用后，與對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率差異不明顯(P＞0.05)，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率也逐漸增加，差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中200μg/mL(P＜0.05)、400μg/mL、800μg/mL和1200μg/mL組最為明顯(P＜0.01)。BGC-823細(xì)胞經(jīng)5-FU(100μg/mL)加牛黃（400μg

9、/mL）和CDDP（50μg/mL）聯(lián)合作用48小時(shí)后，細(xì)胞的凋亡率為38.98±2.65;而空白對(duì)照組和單獨(dú)使用5-FU、CDDP以及5-FU聯(lián)合CDDP組作用48小時(shí)后，細(xì)胞的凋亡率分別為3.68±0.72、9.34±1.79、12.5±1.55、26.8±1.86。各用藥組與對(duì)照組相比較，差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);聯(lián)合用藥組與各組相比較，差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。5-FU+牛黃+CDDP組與5-FU+CD

10、DP組相比較，差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　4.BGC-823細(xì)胞經(jīng)不同濃度的牛黃作用24h后，Hochest33342染色鏡下可見，細(xì)胞出現(xiàn)核熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，細(xì)胞核呈波紋狀，染色質(zhì)凝聚濃染，部分細(xì)胞核固縮，并有凋亡小體，表現(xiàn)為明亮的藍(lán)染的顆粒。隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞逐漸增多，鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。經(jīng)5-FU（100μg/mL）加牛黃(400μg/mL)和CDDP（50μg/mL）聯(lián)合作用48

11、小時(shí)后，這種現(xiàn)象更加明顯。
　　5.DNA凝膠電泳結(jié)果顯示，加牛黃（400μg/mL）、5-FU(100μg/mL)和CDDP（50μg/mL）聯(lián)合與BGC-823細(xì)胞一并培養(yǎng)48小時(shí)后，凝膠上出現(xiàn)的DNA條帶減弱更為明顯。
　　結(jié)論:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)表明，一定濃度的牛黃對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。
　　2.一定濃度的5-FU、CDDP單獨(dú)用藥能抑制人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖。