胃泌素-shRNAs對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823的效應(yīng).pdf

1、胃癌在亞洲有很高的發(fā)病率，也是世界上最常見致死性疾病之一。雖然在一些國(guó)家，其發(fā)病率與致死率有所下降，但從全球范圍看其發(fā)病率依然居高不下。位于胃幽門粘膜處的G細(xì)胞(gastrin-containingcell)是胃泌素合成與分泌的最重要細(xì)胞。胃泌素既可調(diào)節(jié)胃酸的分泌，亦可刺激胃粘膜的增殖。胃癌細(xì)胞系中，腫瘤細(xì)胞以自分泌和旁分泌的方式分泌胃泌素。在胃癌細(xì)胞系BGC-823中，胃泌素被證明是胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)因子。此外，與正常胃粘膜上皮細(xì)胞相比較

2、，胃癌細(xì)胞對(duì)胃泌素增殖作用更為敏感。在胃腺癌病人中，胃泌素表達(dá)檢出率為47．7％(133／279)。胃泌素還具有抗凋亡的效應(yīng)，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，胃泌素基因有可能作為胃癌基因治療的一個(gè)有效的靶基因。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指內(nèi)源性或外源性的一段與目的基因互補(bǔ)的小干擾雙鏈RNA，導(dǎo)入細(xì)胞后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNAi已被成功用來抑制多種生物的基因表達(dá)，更為引人注目的是，其可以作為

3、治療腫瘤的新手段。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，RNAi最初被用做誘導(dǎo)目的基因沉默的工具。Elbashir等人，首次成功的將長(zhǎng)度為2l～23nt的dsRNA導(dǎo)入鼠與人的細(xì)胞，避免了長(zhǎng)于30nt的dsRNA所激活的抗外源病毒侵襲的干擾素反應(yīng)。試驗(yàn)證明小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)能有效的誘發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的靶基因沉默反應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)針對(duì)胃泌素mRNA，篩選4個(gè)不同的靶位點(diǎn)，3個(gè)位點(diǎn)位于胃泌素mRNA的編碼區(qū)內(nèi)，

4、另一位點(diǎn)位于其3’非翻譯區(qū)(3’untranslatedregion，3’UTR)。將4條shRNAs，以lOnm／L、20nm／L、40nm／L和80nm／L的終濃度，分別轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞系，在24h、48h、72h分別收獲細(xì)胞。應(yīng)用原位雜交及免疫組化技術(shù)，檢測(cè)低分化胃癌細(xì)胞系BGC-823中，胃泌素在mRNA和蛋白質(zhì)水平的抑制效應(yīng)。篩選有效的shRNA、濃度及作用時(shí)間。 對(duì)篩選的有效的shRNA序列、濃度及作用時(shí)間

5、，應(yīng)用RT一PCR、MT'I、實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等，進(jìn)一步驗(yàn)證其作用效應(yīng)。 材料與方法 1.shRNA設(shè)計(jì)、合成與鑒定應(yīng)用ambion設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)人胃泌素mRNA不同位點(diǎn)，設(shè)計(jì)4條寡核苷酸序列，命名為DNA模板1、2、3和4，經(jīng)T7體外轉(zhuǎn)錄法形成shRNAs。產(chǎn)物經(jīng)2．5％瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。以DNA模板做參照，判定shRNA的產(chǎn)量。 2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染BGC一823胃癌細(xì)胞系培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPM

6、I一1640培養(yǎng)液中。應(yīng)用CodeBreakerTMsiRNATransfectionReagent，以10nm／L、20nm／L、40nm／L和80nm/L的終濃度，將4條shRNAs分別轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞，僅含轉(zhuǎn)染試劑者為對(duì)照。24h、48h、72h分別收集細(xì)胞，制備細(xì)胞滴片。 3.原位雜交和免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃泌素mRNA和蛋白水平的變化4％多聚甲醛固定細(xì)胞滴片，按胃泌素原位雜交和胃泌素抗體說明書(SABC)進(jìn)行操作

7、，DAB顯色。以不加胃泌素探針和胃泌素抗體為陰性對(duì)照。比較4條shRNA在不同濃度和不同時(shí)間的抑制效應(yīng)，篩選出最有效的shRNA、濃度和作用時(shí)間。 4.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的改變以MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4條shRNAs在不同濃度對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。 5.篩選的有效shRNA片段、濃度和作用時(shí)間的進(jìn)一步鑒定以篩選的有效的shRNA片段和最有效作用濃度轉(zhuǎn)染BGC一823細(xì)胞，以原位雜交(細(xì)胞爬片)和盯一PCR鑒定胃泌素m

8、RNA水平的抑制效應(yīng)，以免疫組織化學(xué)(細(xì)胞爬片)鑒定胃泌素蛋白水平的抑制效應(yīng)，MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的改變。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSSlO．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)；計(jì)量資料，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。以Q：O．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 1.shRNAs的體外合成經(jīng)2．5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，4條shRNAs體外合成成功。 2.原位雜交與免疫組化

9、果作用時(shí)間72h，濃度為80nM時(shí)，shRNA3對(duì)胃癌BGC～823細(xì)胞胃泌素基因抑制最為有效，在mRNA和蛋白水平分別達(dá)到54．27％±O．042和以1．69％±0．038。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0．01)。 3.MTT結(jié)果4條shRNA以4個(gè)不同濃度轉(zhuǎn)染BGC一823細(xì)胞，在48h所測(cè)抑制率均顯著高于對(duì)照組(尸<0．01)，表明胃癌細(xì)胞經(jīng)shRNA處理后生長(zhǎng)受到明顯抑制。 4.篩選的有效shRNA片段、

10、濃度和作用時(shí)間的進(jìn)一步鑒定 (1)原位雜交與免疫組化shRNA3在BGC-823細(xì)胞mRNA和蛋白水平的抑制效率分別為53．94％~0．066和46．63％4-0．049。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較有顯著性差異(尸<0．01)。 (2)RT-PCRshRNA3干擾后72h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胃泌素／-actin比值分別為0．544-0．29和1．044-0．22，抑制率為48．1％。實(shí)驗(yàn)組比值較對(duì)照組有顯著差別(尸

11、 (3)MTT實(shí)驗(yàn)shRNA3處理組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較對(duì)照組明顯降低，表明shRNA3對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制可維持一定時(shí)間。 (4)流式細(xì)胞技術(shù)shRNA3干擾后72h，Go-G。期細(xì)胞數(shù)由空白對(duì)照的50．3％i升為62．7％，G2／M期細(xì)胞數(shù)由空白對(duì)照的17．5％上升為27．1％，而S期細(xì)胞數(shù)由32．2％下降為10．2％。 結(jié)論 1.胃泌素-shRNA3為有效抑制胃泌素表達(dá)的shRNA。 2.泌素-sh