HCV核心蛋白作用下的巨噬細胞變化及在肝細胞增殖中的相互作用.pdf

1、目的:
　　 越來越多研究表明，嗜肝性丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)是導致慢性化肝炎、乃至原發(fā)性肝癌的主要病原體，HCV不僅可以感染肝細胞，在很多免疫細胞（如B細胞、T細胞、單核巨噬細胞）內也可檢測到HCV的復制，且HCV的病毒蛋白可與寄宿細胞內、外的相應蛋白或受體結合，影響該細胞的生物學活性:如非結構蛋白NS3可通過封閉TLR3途徑抑制固有免疫應答或通過活化TLR2受體途徑促進固有免疫應答發(fā)生;胞膜蛋白

2、E2與NK細胞表面受體CD81結合抑制NK細胞功能等。提示在HCV感染宿主過程中，與宿主免疫細胞可能通過多種途徑相互作用，而HCV、免疫細胞、肝細胞三者的相互影響，既有可能促使HCV的清除，也有可能有利于HCV的免疫逃逸，導致慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌(HCC)的發(fā)生。
　　 HCV核心蛋白(HCVcore)作為HCV的重要結構蛋白，是病毒核衣殼的組成部分，除參與病毒的組裝，還會影響著宿主細胞內的信號轉導、物質代謝以及凋亡等一系

3、列生化過程:如轉染HCVcore的HepG2可通過自分泌TGF-α，引起細胞內MAPK/ERK通路活化，最終導致HepG2的增殖加快;HCVcore還可抑制抑癌基因p53啟動子的活性，參與HCC的發(fā)生。庫否氏細胞是定居于肝臟內的一類重要的巨噬細胞，約占肝臟細胞總數(shù)的15％～20％，發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視和免疫調節(jié)作用。然而在HCV持續(xù)感染時，表達HCVcore蛋白的受體C1qR的單核細胞可被募集到肝臟組織，在肝臟炎性微環(huán)境中分化為不同亞型的

4、巨噬細胞，包括經(jīng)典激活的巨噬細胞M1、替代途徑激活的巨噬細胞M2、腫瘤相關巨噬細胞、髓系來源的抑制細胞等，這些不同亞型巨噬細胞可分泌不同的細胞因子，在病毒的感染與腫瘤的形成及擴散中發(fā)揮不同的作用。換言之，在HCV的慢性感染過程中，HCVcore蛋白與巨噬細胞表面受體C1qR結合導致巨噬細胞發(fā)生了哪些生物學變化，這些變化與HCV所致的疾病的進程有哪些關系，以及在肝臟微環(huán)境中肝細胞與巨噬細胞之間是如何互相制約，互相協(xié)調都不十分清楚。

5、　　 本研究旨在了解在HCVcore蛋白作用下的巨噬細胞與不同的人肝細胞株相互作用后，肝細胞和巨噬細胞發(fā)生的變化，以期探討巨噬細胞在HCV導致的HCC中所充當?shù)慕巧?，為HCV的慢性化機制的研究和免疫治療提供新的視角。因此，采用了以下實驗策略:1、應用原核表達系統(tǒng)獲得HCVcore蛋白，作用巨噬細胞后，分別收集細胞培養(yǎng)上清及巨噬細胞與不同人肝細胞株(L02、HepG2)相互作用，研究HCVcore蛋白作用后的巨噬細胞與肝細胞增殖的關系;

6、2、在了解HCV作用下的巨噬細胞培養(yǎng)上清可以促肝細胞增殖的前提下，用Transwell小室培養(yǎng)系統(tǒng)（非直接接觸）共培養(yǎng)HCVcore蛋白、巨噬細胞及人肝細胞株（L02、HepG2），通過肝細胞內信號轉導分子表達的變化，深入研究相關機制;3、根據(jù)以上實驗結果，通過RT-PCR、ELISA、Westernblot、流式細胞術等手段了解巨噬細胞內轉錄因子、炎性細胞因子以及細胞膜分子的變化以深入揭示HCVcore蛋白以及肝細胞代謝對巨噬細胞的作

7、用。
　　 方法:
　　 1、PCR方法從JFH-1株(HCV2a)全長基因質粒上擴增HCVcore基因，克隆至pMD18-T載體并測序，后經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，將其克隆至原核表達質粒pET-28a構建重組原核表達質粒pET-28a/HCVcore，通過IPTG誘導獲得高效表達目的蛋白的包涵體，經(jīng)純化和復性、LPS定量檢測后，行SDS-PAGE和Westernblot鑒定。
　　 2、PMA誘導人單核細

8、胞株Thp1分化為巨噬細胞PMA-Thp1，以RT-PCR檢測HCVcore蛋白作用后細胞表面受體C1qRmRNA表達水平，驗證原核表達蛋白HCVcore的生物學活性，同時設PBS、LPS作用PMA-Thp1作為對照;使用不同濃度HCVcore蛋白作用PMA-Thp1，確定HCVcore蛋白作用最適濃度。
　　 3、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1后收集細胞培養(yǎng)上清，以不同濃度（10％細胞培養(yǎng)上清+90％完全培養(yǎng)基、20％

9、細胞培養(yǎng)上清+80％完全培養(yǎng)基、40％細胞培養(yǎng)上清+60％完全培養(yǎng)基）分別與人肝細胞株L02、HepG2共培養(yǎng)，CCK8法檢測培養(yǎng)不同時間點(24h、48h、72h)肝細胞增殖的動態(tài)變化，同時設PBS作用的PMA-Thp1細胞培養(yǎng)上清或僅含有HCVcore蛋白的完全培養(yǎng)基作用的肝細胞組作為陰性對照和蛋白對照。
　　 4、HCVcore蛋白作用PMA-Thp124h后收集PMA-Thp1細胞，經(jīng)絲裂霉素處理后分別與人肝細胞株L02

10、、HepG2共培養(yǎng)（肝細胞與PMA-Thp1細胞數(shù)比值分別為25∶1、50∶1），CCK8法檢測培養(yǎng)不同時間點(24h、48h、72h)肝細胞增殖的動態(tài)變化，同時以PBS作用的PMA-Thp1細胞或僅含完全培養(yǎng)作用的肝細胞組作為陰性對照和陽性對照。
　　 5、用Transwell小室培養(yǎng)系統(tǒng)將HCVcore蛋白作用的PMA-Thp1細胞分別與人肝細胞株L02、HepG2（非直接接觸）共培養(yǎng)24h，行Westernblot檢測肝細

11、胞內MAPK通路相關蛋白(ERK、JNK、p38)的活性，同時設PBS作用PMA-Thp1共培養(yǎng)的肝細胞組、HCVcore單獨作用的肝細胞組及肝細胞組作為對照。
　　 6、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1后，RT-PCR檢測PMA-Thp1細胞促炎和抗炎因子（IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-8、TGF-β）mRNA水平變化;ELISA檢測PMA-Thp1細胞培養(yǎng)上清抗炎因子TGF-β的表達變化;流式細胞術檢測PM

12、A-Thp1細胞膜表面與M1、M2巨噬細胞表型有關分子(CD14、CD16、CD206、CD86)表達變化，同時設PBS、LPS、LPS+HCVcore作用的PMA-Thp1組作為對照;Westernblot檢測HCVcore蛋白、肝細胞共同作用的PMA-Thp1細胞內轉錄因子(NF-κB、STAT3、STAT1)的活性。
　　 結果:
　　 1、成功構建了pET28a/HCVcore原核表達質粒，并得以表達。經(jīng)鱟試劑檢

13、測表達蛋白中LPS含量為0.9EU/ml。SDS-PAGE電泳和Westernblot結果顯示，純化后獲得分子量約為21KD的單一條帶，可與鼠抗人HCVcore單克隆抗體特異性雜交。
　　 2、經(jīng)細胞形態(tài)學觀察和流式細胞術檢測細胞表面分子(CD11b、CD11c)，結果顯示，以40ng/ml佛波酯(PMA)作用Thp148h后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，巨噬細胞特異的細胞表面分子CD11b、CD11cmRNA水平顯著升高(P＜0.05)

14、。
　　 3、Real-timePCR結果顯示:HCVcore蛋白作用PMA-Thp16h、12h后其受體C1qRmRNA水平顯著高于對照組(P＜0.05);并確定HCVcore作用PMA-Thp1最適濃度為10μg/ml。
　　 4、細胞增殖曲線顯示HCVcore蛋白作用PMA-Thp1收集細胞培養(yǎng)上清對L02細胞增殖的影響:與陰性對照組相比，不同濃度細胞培養(yǎng)上清均使L02細胞增殖加快;與陰性對照和蛋白對照組相比，20

15、％細胞培養(yǎng)上清使L02增殖顯著(P＜0.05)。
　　 5、細胞增殖曲線顯示HCVcore蛋白作用PMA-Thp1收集細胞培養(yǎng)上清對HepG2細胞增殖的影響:10％細胞培養(yǎng)上清作用的HepG2在24h、48h、72h時間點生長均大于陰性對照和蛋白對照組，其中48h、72h時間點差別顯著(P＜0.05)，20％上清組和40％上清組對HepG2增殖作用不明顯。
　　 6、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1后收集的細胞經(jīng)絲

16、裂霉素固定后與肝細胞共培養(yǎng)，與對照組相比，無明顯促肝細胞增殖作用，說明巨噬細胞膜分子對肝細胞增殖作用無影響。
　　 7、Westernblot顯示HCVcore蛋白作用PMA-Thp1與人肝細胞株共培養(yǎng)后，與對照組比較，L02細胞內磷酸化的ERK表達明顯升高，但磷酸化的JNK和p38表達沒有改變;而HepG2細胞內只有磷酸化的JNK表達明顯升高。
　　 8、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1不同時間后，(1)RT-P

17、CR結果顯示:細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-8、TGF-βmRNA水平與PBS對照組比較均有明顯改變(P＜0.05);(2)ELISA結果顯示:細胞培養(yǎng)上清中TGF-β的表達明顯高于對照組(P＜0.05)，含量為168pg/ml;(3)流式細胞術檢測結果顯示:細胞膜表面分子CD14、CD16、CD206的表達與其他三組均無區(qū)別，CD86表達與PBS作用組相同;(4)Westernblot結果顯示:與PBS對照組相比，

18、磷酸化的NF-κB65和NF-κB105表達在1h和4h升高，磷酸化的STAT1和STATR3表達無明顯動態(tài)改變。
　　 9、HCVcore蛋白、肝細胞、巨噬細胞三者相互作用致與巨噬細胞分化有關的轉錄因子的表達和活化:(1)與core蛋白、L02細胞共培養(yǎng)的巨噬細胞磷酸化的STAT3的表達明顯增加，而與core蛋白、HepG2共培養(yǎng)的巨噬細胞的磷酸化STAT3的表達則無明顯改變;(2)與L02細胞、巨噬細胞共培養(yǎng)的對照組相比，L

19、02、巨噬細胞、core蛋白三者共培養(yǎng)致磷酸化的STAT3表達升高的同時，磷酸化的STAT1表達為降低狀態(tài)。
　　 結論:
　　 1、成功構建、表達了具有生物學活性的HCVcore蛋白。
　　 2、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1巨噬細胞后的細胞上清有促進肝細胞株L02、HepG2增殖的作用，可能與巨噬細胞分泌的可溶性因子有關，而與巨噬細胞表面分子以及HCVcore蛋白直接作用無關。
　　 3、HC

20、Vcore蛋白作用PMA-Thp1后促進肝細胞的增殖，在L02細胞可能與上調磷酸化的ERK表達相關，反之，L02細胞、core蛋白、巨噬細胞三者共培養(yǎng)可上調巨噬細胞內磷酸化STAT3的含量。而對HepG2細胞的影響僅表現(xiàn)為磷酸化的JNK含量上調，HepG2對巨噬細胞的影響作用不明顯。
　　 4、HCVcore蛋白作用PMA-Thp1可致細胞轉錄因子和細胞因子表達發(fā)生動態(tài)改變，但與不同肝細胞相互作用后的結果不完全相同，提示與不同特