弓形蟲感染人細胞LncRNAs差異表達及功能研究.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）可寄生于包括人在內(nèi)的幾乎所有溫血動物的有核細胞，其感染所致的弓形蟲病（to xop las mos is）是世界范圍內(nèi)流行的人獸共患的機會性寄生蟲病。人們對弓形蟲普遍易感，一般健康的人感染弓形蟲會產(chǎn)生免疫力限制弓形蟲增殖，然而抵抗力底下的患者如：妊娠婦女、癌癥患者、免疫缺陷者感染弓形蟲后可引起嚴重后果。弓形蟲被認為介導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)以建立終身慢性感染，但其調(diào)控機制尚不清楚。在本研究中，我們應(yīng)

2、用微陣列分析來探討弓形蟲感染的人包皮成纖維細胞（HFF）細胞中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達譜，我們檢測到寄生蟲感染后差異表達的lncRNA和mRNA的很大改變。通過GO和Pathway通路分析，差異表達的mRNA顯示主要參與宿主免疫信號通路。結(jié)合LncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)篩選出差異表達NONHSAT022487–UNC93B1共表達對，并應(yīng)用qPCR、WB從mRNA及蛋白水平在HFF及THP1兩種細胞中進行驗證。然后采用干擾腺病毒

3、載體shRNA-NONHSAT022487或?qū)雙cDNA3.1-NONHSAT022487過表達載體，從功能缺失和功能獲得兩方面研究其對靶基因UNC93B1表達及生物學(xué)行為影響。值得注意的是，我們確定NONSHAT022487作為免疫相關(guān)基因UNC93B1的負調(diào)節(jié)因子，已知UNC93B1是誘導(dǎo)巨噬細胞中細胞因子產(chǎn)生和自主控制弓形體復(fù)制的關(guān)鍵因素。我們進一步發(fā)現(xiàn)由弓形蟲感染誘導(dǎo)的lncRNA-NONSHAT022487通過下調(diào)人源巨細胞

4、細胞中的UNC93B1表達而損害細胞因子IL-12，TNF-α，IL-6，IL-1β和IFN-γ的分泌。我們的研究結(jié)果揭示了一種新的調(diào)控機制，其中弓形體寄生蟲調(diào)節(jié)宿主免疫信號通路，并可能提供抗擊弓形蟲病的潛在目標。
　　目的：研究弓形蟲感染后的人包皮成纖維細胞LncRNA的差異表達，確定感染誘導(dǎo)的lncRN A表達作為一種新的機制，通過這種機制，弓形蟲寄生蟲調(diào)節(jié)宿主免疫信號通路。這種機制可能提供抗擊弓形體病的潛在目標。
　　

5、方法：⑴通過基因芯片分析正常細胞組、滅活速殖子組、速殖子組3組長鏈非編碼RNA和mRNA差異表達，以>5 fold為基礎(chǔ)篩選出差異倍數(shù)大的基因，為以后研究LncRNA功能奠定基礎(chǔ)。⑵從大于5倍差異表達基因中隨機抽取20種LncRNAs和10種mRNAs,并運用Primer5軟件設(shè)計引物，選取特異性高的引物，并采用PCR儀進行PCR產(chǎn)物的擴增。⑶采用ABI7300熒光實時定量PCR檢測來自正常細胞組、滅活速殖子組、速殖子組3組差異顯著的2

6、0種LncRNAs和10種mRNAs進行驗證；⑷根據(jù)GO注釋，對差異倍數(shù)大于5倍的mRNA進行GO分析；以及mRNAs的Pathway通路分析。⑸選出與免疫相關(guān)的一些 mRNAs構(gòu)建共表達以方便篩選出與本課題相關(guān)的LncRNA進行后續(xù)功能研究。⑹根據(jù)共表達網(wǎng)絡(luò)篩選出 NONHSAT022487-UNC93B1共表達對，由于UNC93B1抗弓形蟲感染，并采用 RT-PCR對其進行檢測，發(fā)現(xiàn)NONHSAT022487上調(diào)明顯，UNC93B1

7、下調(diào)明顯并采用Western Blot檢測UNC93B1表達量下調(diào)，結(jié)果與芯片結(jié)果一致。⑺將 NONHSAT022487基因序列交給上海吉瑪公司設(shè)計干擾序列，并篩選出合適的干擾序列構(gòu)建干擾腺病毒載體。⑻構(gòu)建干擾腺病毒shRNA-NONHSAT022487成功后，并用其感染HFF和THP1兩種細胞，采用實時熒光定量 PCR檢測其干擾效果，以及干擾后靶基因UNC93B1表達量變化。⑼構(gòu)建NONHSAT022487過表達質(zhì)粒，并采用PCR儀進

8、行菌液PCR檢測，確保構(gòu)建過表達載體成功。⑽將構(gòu)建成功的過表達載體轉(zhuǎn)染HFF和THP1兩種細胞，采用熒光定量PCR檢測NONHSAT022487表達效果，以及過表達后靶基因UNC93B1表達量變化；⑾Western Blot檢測NONHSAT022487干擾和過表達后，在HFF和THP1兩種細胞中靶基因UNC93B1表達變化情況。⑿采用Elisa方法檢測NONHSAT022487干擾和過表達后，弓形蟲感染THP1細胞后，IL-1beta

9、、IL-6、TNF、IFN-gama、IL-12等細胞因子變化；
　　結(jié)果：①基因芯片數(shù)據(jù)分析，篩選出差異顯著的LncRNAs和mRNAs（>5倍，P＜0.05），隨機抽取20種LncRNAs和10種mRNAs進行RT-PCR檢測,結(jié)果與芯片大體一致。②根據(jù)GO和Pathway分析，以及LncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)分析，依據(jù)課題研究我們篩選出NONHSAT022487-UNC93B1共表達網(wǎng)絡(luò)對，進行功能研究。③基因芯片和熒光

10、實時定量PCR提示長非編碼NONHSAT022487在弓形蟲感染宿主細胞與滅活組以及正常組相比之間存在明顯的差異表達，弓形蟲感染宿主細胞中表達明顯上調(diào)。然而根據(jù) LncRN A-mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)分析，其預(yù)測調(diào)控靶基因UNC93B1在弓形蟲感染宿主細胞中明顯下調(diào)。④通過構(gòu)建LncRNA-NONHSAT022487干擾腺病毒載體轉(zhuǎn)染HFF和 THP1兩種細胞48h，用RT-PCR檢測其干擾效率，發(fā)現(xiàn)NONHSAT022487表達量明顯下調(diào)

11、，而靶基因UNC93B1表達量明顯上調(diào)。⑤構(gòu)建pcDNA3.1-NONHSAT022487過表達載體，并轉(zhuǎn)染HFF和THP1兩種細胞，RT-PCR檢測NONHSAT022487過表達后其表達量明顯上調(diào)，RT-PCR及Western Blot檢測靶基因UNC93B1表達量明顯下調(diào)。⑥Elisa檢測NONHSAT022487干擾后，弓形蟲感染刺激THP1細胞分泌IL-1beta、IL-6、TNF、IFN-gama、IL-12等細胞因子，結(jié)果