篩選和鑒定與剛地弓形蟲微線體蛋白6C端相互作用的蛋白.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲，呈世界性分布。人群感染極為普遍，許多國家和地區(qū)的感染率達25％～50％。正常人群感染弓形蟲后一般沒有明顯的臨床癥狀，但在免疫功能低下的腫瘤患者、器官移植接受者和艾滋病患者等特殊人群，感染的蟲體可以大量增殖，引起全身播散性損害，成為患者死亡的重要原因之一。婦女在懷孕期間感染T．gondii，可將其垂直傳播給胎兒，造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和畸形等，存活的胎兒也往往有嚴重的

2、后遺癥。弓形蟲病又是一種人獸共患病，其暴發(fā)流行對畜牧業(yè)造成極大的損失。目前弓形蟲病的治療并無特效藥物，傳統(tǒng)的乙胺嘧啶和磺胺嘧啶因在長期使用中表現(xiàn)的毒副作用使其應用受到限制。 研究目的和意義： 有多個分子參與了弓形蟲入侵宿主細胞的過程，如Ca2+、三種微線體復合體(MIC6-MIC1-MIC4、MIC2-M2AP和MIC3-MIC8)、棒狀體蛋白和肌動蛋白等。其中微線體復合體和肌動蛋白發(fā)揮著重要的作用，微線體復合體依靠其獨

3、特的黏附結(jié)構(gòu)域識別、黏附宿主細胞，肌動蛋白為入侵提供動力支持。已有研究證實弓形蟲的醛縮酶與MIC2-M2AP復合體中的跨膜蛋白MIC2的C端片段相互作用，將入侵識別蛋白MIC2-M2AP復合體和動力蛋白肌動蛋白相連接，從而闡明了弓形蟲入侵相關分子MIC2-M2AP復合體參與蟲體入侵的模式。MIC6-MIC1-MIC4微線體復合體在蟲體入侵過程中同樣發(fā)揮著重要作用，該復合體中的跨膜蛋白MIC6是由何種蛋白介導與動力系統(tǒng)的連接，目前卻未見相

4、關的研究報道。本研究的目的旨在篩選并鑒定與TgMIC6蛋白C端相互作用的蛋白，探討在MIC6-MIC1-MIC4微線體復合體和肌動蛋白之間起橋梁作用的蛋白，闡明MIC6-MIC1-MIC4復合體參與蟲體入侵的模式，為進一步研究T．gondii的入侵機制奠定基礎；同時，T．gondii作為一模式生物，它的入侵機制的研究可以為頂復門其它寄生原蟲的研究提供參考。 研究方法： 1、GST—MIC6C蛋白及其多克隆抗體的制備

5、 以弓形蟲的cDNA為模板，PCR擴增MIC6C基因片段；構(gòu)建MIC6C/pGEX—4T-1重組質(zhì)粒，IPTG誘導表達融合蛋白GST—MIC6C；親和層析純化融合蛋白，核酸蛋白儀分析蛋白濃度。融合蛋白GST—MIC6C皮內(nèi)多點注射免疫動物(新西蘭兔和SD大鼠)，收集抗血清，親和層析純化，制備GST—MIC6C多克隆抗體。 2、篩選并鑒定與MIC6C作用的蛋白 制備弓形蟲速殖子裂解液；以GST—MIC6C為探針蛋白、GS

6、T為對照蛋白，采用GST沉降技術(shù)從弓形蟲速殖子裂解液中篩選蛋白，SDS—PAGE分析，蛋白條帶N端測序，BLAST2在線相似搜索，初步確定蛋白。構(gòu)建Aldolase/pET30a重組原核表達系統(tǒng)，誘導表達重組蛋白；親和層析純化；重組蛋白免疫動物，收集抗血清并純化，棋盤滴定法測定純化的Aldolase—His多克隆抗體的效價。相同方法制備Actin—His蛋白及其多克隆抗體。用大鼠源性Aldolase—His多克隆抗體和Actin—His

7、多克隆抗體作為一抗，兔抗大鼠IgG—HRP為二抗，Western blot分析GST沉降初篩產(chǎn)物，ECM法檢測。 用兔源性GST—MIC6C多克隆抗體包被protein G sepharose，兔免疫前血清為對照，與速殖子裂解液進行免疫共沉淀實驗，SDS—PAGE分析；分別以大鼠源性GST—MIC6C多克隆抗體、Aldolase—His多克隆抗體和Aldolase—His多克隆抗體為一抗，兔抗大鼠IgG—HRP為二抗，Weste

8、rn blot分析免疫共沉淀產(chǎn)物，ECM法檢測。 制備GST—aldolase蛋白，與Actin—His蛋白液進行GST沉降實驗。 3、MIC6C與Aldolase的作用位點及其在蟲體內(nèi)的定位 設計MIC6C W/V突變體基因擴增用引物，PCR擴增MIC6C W/V突變體基因；構(gòu)建MIC6C W/V/pGEX—4T-1重組載體，誘導表達GST—MIC6C W/V突變體蛋白，親和層析純化蛋白。以GST—MIC6C蛋

9、白為陽性對照，GST—MIC6C W/V突變體蛋白為探針蛋白與速殖子裂解液進行GST沉降實驗，SDS—PAGE；分別以大鼠源性Aldolase—His多克隆抗體和Actin—His多克隆抗體作為一抗，兔抗大鼠IgG—HRP為二抗，Western blot分析GST沉降產(chǎn)物。相同方法制備GST—MIC2C蛋白及其多克隆抗體；制備GST—MIC2C W/A突變體蛋白。以GST—MIC2C蛋白和GST—MIC2C W/A突變體蛋白為陽性對照，

10、GST—MIC6C蛋白和GST—MIC6CW/V突變體蛋白為探針蛋白分別與速殖子裂解液進行GST沉降實驗，SDS—PAGE分析。 制備弓形蟲速殖子涂片，常規(guī)固定、封閉；用兔源性GST—MIC6C多克隆抗體和鼠源性aldolase—His多克隆抗體作為一抗，先用羊抗兔IgG—TRITC熒光二抗進行溫育，再用兔抗大鼠IgG—FITC熒光二抗溫育，熒光顯微鏡下觀察并拍照，圖像分析軟件分析。一抗采為兔源性GST—MIC2C多克隆抗體和鼠

11、源性aldolase—His多克隆抗體，相同方法對MIC2和Aldolase進行間接免疫熒光定位。 研究結(jié)果： 1、GST—MIC6C蛋白及其多克隆抗體的制備 成功構(gòu)建了MIC6C/pGEX—4T-1重組質(zhì)粒，并誘導表達了目的蛋白；親和層析法純化融合蛋白GST—MIC6C，核酸蛋白儀分析其濃度為3.23mg/ml。用GST—MIC6C蛋白分別皮內(nèi)多點注射免疫新西蘭兔和SD大鼠，收集抗血清，親和層析法純化抗體，棋盤

12、滴定法測定兔源性GST—MIC6C多克隆抗體的效價為1:8000，大鼠源性GST—MIC6C多克隆抗體的效價為1:4000。 2、篩選并鑒定與MIC6C作用的蛋白 GST—MIC6C與弓形蟲速殖子裂解液進行GST沉降實驗產(chǎn)物中有蛋白條帶，而以GST為對照蛋白的GST沉降實驗產(chǎn)物中沒有相應的蛋白條帶。蛋白N端測序結(jié)果經(jīng)BLAST2在線相似搜索，與醛縮酶(aldolase)蛋白的N端序列完全一致。成功構(gòu)建了Aldolase

13、/pET30a和Actin/pET30a原核表達系統(tǒng)，誘導表達并純化，獲得了純化的重組蛋白。Aldolase—His蛋白濃度為7.28mg/ml；Actin—His蛋白濃度為0.35mg/ml。重組蛋白的多克隆抗體效價為1:4000。用大鼠源性Aldolase—His多克隆抗體和Actin—His多克隆抗體作為一抗，兔抗大鼠IgG—HRP為二抗，Western blot分析GST沉降初篩產(chǎn)物，X—感光膠片顯示GST—MIC6C與弓形蟲速

14、殖子裂解液GST沉降產(chǎn)物中有蛋白條帶可分別被上述一抗識別。 GST—MIC6C多克隆抗體包被的protein G sepharose與弓形蟲裂解液的免疫共沉淀產(chǎn)物中有蛋白條帶可分別被GST—MIC6C抗體、Aldolase—His抗體和Actin—His抗體識別，而在免疫前血清的免疫共沉淀產(chǎn)物中卻沒有可以識別的蛋白條帶。 以GST—aldolase為探針蛋白與Actin—His蛋白液的GST沉降產(chǎn)物中有蛋白條帶，且大小

15、與Actin—His相符，而GST對照蛋白的GST沉降產(chǎn)物中則沒有蛋白條帶。 3、MIC6C與Aldolase的作用位點及其在蟲體內(nèi)的定位 獲得了GST—MIC6CW/V突變體蛋白，蛋白濃度為1.78mg/ml。GST—MIC6CW/V蛋白與速殖子裂解液的GST沉降產(chǎn)物中沒有蛋白條帶。Western blot顯示在GST—MIC6C的GST沉降產(chǎn)物中有蛋白條帶可分別被特異的一抗所識別，而GST—MIC6CW/V蛋白的產(chǎn)物

16、中則沒有。制備了GST—MIC2C、GST—MIC2CW/A蛋白和GST—MIC2C多克隆抗體，蛋白濃度分別為3.07mg/ml和2.55mg/ml?？贵w的效價為1:8000。GST—MIC6C和GST—MIC2C蛋白分別與速殖子裂解液的GST沉降產(chǎn)物中可見蛋白條帶，而GST—MIC6CW/V和GST—MIC2CW/A突變體蛋白的GST沉降產(chǎn)物中則沒有目的條帶。 間接免疫熒光定位顯示：MIC6(紅色熒光)和Aldolase(綠色