骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)百草枯中毒導(dǎo)致肺纖維化的影響及機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　百草枯（Paraquat，PQ）是農(nóng)業(yè)中常用的一種非選擇性的速效觸滅型除草劑。急性PQ中毒可引起多臟器功能損害，其中以肺的損害最為常見和突出，中毒早期可出現(xiàn)彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡上皮細(xì)胞受損、充血水腫，甚至肺泡內(nèi)出血等急性表現(xiàn)，后期可出現(xiàn)不可逆的肺纖維化，嚴(yán)重影響患者的存活率和生存質(zhì)量。目前對(duì)于急性PQ中毒的救治尚無特效解毒藥，僅能通過早期一般的中毒治療措施、血液凈化以及免疫抑制劑、激素和對(duì)癥支持等予以救治，故P

2、Q中毒的死亡率占急性中毒死亡率的絕大部分。因此，探尋急性PQ中毒導(dǎo)致的肺纖維化的新的治療方法成為急性中毒救治十分有意義的研究方向。
　　干細(xì)胞具有自我更新、多向分化及移植體內(nèi)后有分泌、趨化等特性，正是利用干細(xì)胞以上這些特性，將干細(xì)胞移植入體內(nèi)已成為目前一項(xiàng)很有發(fā)展前景的細(xì)胞治療技術(shù)，并已逐步應(yīng)用于各種損傷性肺疾病的研究中，如博來霉素、LPS誘導(dǎo)的肺損傷動(dòng)物模型，以期能阻止各類肺疾病的進(jìn)一步發(fā)展，因此也提示了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bon

3、e Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）移植在PQ中毒治療中可能具有一定的應(yīng)用前景。
　　研究目的：
　　觀察外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠急性PQ中毒導(dǎo)致的肺纖維化是否有改善作用及其可能的機(jī)制。
　　研究方法：
　　1、大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　取SD大鼠體重100g-120g，無菌條件下分離雙下肢，DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓液，利用干細(xì)胞

4、貼壁的特性分離并純化大鼠 BMSCs，傳至第三代鏡下觀察 BMSCs，可見細(xì)胞呈梭形，成纖維細(xì)胞樣形態(tài)、大小均一、漩渦狀排列生長(zhǎng)；并取第三代BMSCs通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型。
　　2、BMSCs對(duì)PQ中毒導(dǎo)致的肺纖維化的影響及機(jī)制
　　取SD雄性大鼠，共27只，隨機(jī)分成3組，A組：（空白對(duì)照組），B組：（PQ+PBS組），C組：（PQ+BMSCs組），其中B組、C組均以120mg/kg的PQ溶液予以一次性灌胃染毒，染毒后

5、6h C組大鼠予以尾靜脈注入BMSCs1×106個(gè)/ml，而B組大鼠則予以注入相應(yīng)劑量的PBS。觀察各組大鼠的一般情況，于染毒后第7天、14天、28天處死未死亡的大鼠，取左下肺組織，行HE和Masson染色觀察各組肺組織的病理改變情況，根據(jù)Szapiel肺泡炎和肺纖維化的分級(jí)法進(jìn)行肺纖維化評(píng)分，并行免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺組織中TGF-β1及HGF的表達(dá)情況；取右下肺，檢測(cè)HYP對(duì)比各組肺組織中含量的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1

6、、大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)結(jié)果，鏡下可見第6-9天后細(xì)胞分裂增殖明顯，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞群呈“旋渦樣”緊密排列，第9-11天左右細(xì)胞可逐漸融合呈單層，鋪滿瓶底。第三代BMSCs通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，結(jié)果顯示細(xì)胞均表達(dá)CD29、CD90抗原分子，不表達(dá)CD45、CD11b抗原分子。說明利用全骨髓貼壁分離法可以獲得足夠數(shù)量的、高純度的、生長(zhǎng)旺盛的大鼠BMSCs。
　　2、BMSCs對(duì)PQ

7、中毒導(dǎo)致的肺纖維化的影響及機(jī)制
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C組的大鼠肺纖維化程度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較B組明顯減輕。C組肺纖維化評(píng)分、HYP含量均低于B組，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示B組、C組各時(shí)間點(diǎn)肺組織表達(dá)的TGF-β1含量均較A組增高，且第7天表達(dá)含量最高，此后逐漸減低，但仍高于A組，其中C組的含量相比B組較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組、C組HGF的表達(dá)含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，到28天達(dá)到最高峰，其中C組在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)含量均較A組和B組增高，