ISEcp1介導(dǎo)志賀菌耐藥的分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、志賀菌屬細(xì)菌又稱痢疾桿菌，是細(xì)菌性痢疾（簡(jiǎn)稱菌痢）的病原體。菌痢是全球都存在的一個(gè)公共衛(wèi)生問題，尤其對(duì)發(fā)展中國(guó)家造成重大危害。志賀菌屬根據(jù)O抗原分為4個(gè)群:分別為痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌和宋內(nèi)志賀菌。隨著人們對(duì)各種抗生素持續(xù)廣泛的應(yīng)用，甚至濫用，使志賀菌耐藥現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重，不但影響臨床療效，而且嚴(yán)重增加治療成本和新藥研發(fā)成本，并使新藥應(yīng)用于臨床的周期縮短。因此，研究志賀菌耐藥機(jī)制，進(jìn)而為志賀菌耐藥的防治提供科學(xué)依據(jù)和有效手段，已

2、成為目前的研究熱點(diǎn)。
　　插入序列(IS)是可以獨(dú)立存在的遺傳單元，是染色體的特殊組成部分，可以從染色體上的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置，或在不同染色體間跳躍。最近有學(xué)者報(bào)道，ISEcp1可能與細(xì)菌β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥有關(guān)。
　　目的：
　　本課題通過藥物誘導(dǎo)、基因測(cè)序等手段，比較志賀菌敏感株誘導(dǎo)前后ISEcp1與blaCTX-M的位置關(guān)系及blaCTX-M的表達(dá)的變化，以闡明ISEcp1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座影響細(xì)菌耐藥的分子機(jī)制。

3、并進(jìn)一步收集志賀菌株進(jìn)行ISEcp1、blaCTX-M的分布、頭孢菌素耐藥情況及二者對(duì)應(yīng)關(guān)系的分析，從而對(duì)所闡明的機(jī)制提供現(xiàn)場(chǎng)佐證。
　　方法：
　　1.志賀菌的收集、鑒定:從河南、江西收集志賀菌233株，并進(jìn)行血清、生化鑒定;
　　2.藥敏試驗(yàn):用紙片擴(kuò)散法測(cè)定菌株對(duì)所研究抗生素藥敏紙片的抑菌環(huán)，用瓊脂稀釋法測(cè)定菌株的最低抑菌濃度;
　　3.頭孢噻吩次抑菌濃度誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn):采用改良K-B法篩選臨床分離、鑒定的志賀菌

4、敏感株，用瓊脂稀釋法測(cè)定志賀菌敏感株對(duì)頭孢噻吩的最低抑菌濃度，采用頭孢噻吩次抑菌濃度誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建志賀菌誘導(dǎo)耐藥株;
　　4.全基因組測(cè)序分析比較志賀菌敏感株誘導(dǎo)前后差異:Solexa全基因組測(cè)序，并利用Clustal等生物學(xué)軟件進(jìn)行比較、分析;
　　5.ISEcp1轉(zhuǎn)座及對(duì)blaCTX-M表達(dá)的影響:通過PCR、克隆和測(cè)序分析比較誘導(dǎo)前后ISEcp1與blaCTX-M的位置關(guān)系;并將克隆構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，K-

5、B瓊脂法對(duì)不同轉(zhuǎn)化子進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶表型確證試驗(yàn)，同時(shí)做RT-PCR，闡明ISEcp1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座后對(duì)blaCTX-M的表達(dá)的影響;
　　6.ISEcp與blaCTX-M的分布及菌株耐藥情況:PCR檢測(cè)所收集志賀菌的ISEcp1與blaCTX-M，K-B實(shí)驗(yàn)進(jìn)行頭孢菌素耐藥性檢測(cè)，將耐藥情況與所檢測(cè)目的基因進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)志賀菌敏感株mel-sf1998023/zz進(jìn)行頭孢噻吩次抑菌濃

6、度誘導(dǎo)，最終得到誘導(dǎo)后頭孢噻吩MIC為512mg/L，是誘導(dǎo)前出發(fā)菌株的32倍。
　　2.頭孢噻吩誘導(dǎo)志賀菌敏感株mel-sf1998023/zz的前后，不但對(duì)頭孢噻吩的耐藥性發(fā)生了改變，同時(shí)測(cè)得誘導(dǎo)后菌株對(duì)頭孢唑啉、頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟均由敏感轉(zhuǎn)變?yōu)槟退帯?br>　　3.頭孢噻吩誘導(dǎo)志賀菌敏感株使其耐藥后，基因組序列發(fā)生了改變，不但有SNV，還造成了新的插入和缺失，且誘導(dǎo)前后菌株插入序列的拷貝數(shù)發(fā)生了變化。<

7、br>　　4.通過比較志賀菌出發(fā)敏感株與誘導(dǎo)耐藥株的KEGG代謝通路發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)耐藥株比出發(fā)敏感株多一個(gè)代謝通路ko00930:Caprolactam degradation，即己內(nèi)酰胺代謝通路。
　　5.志賀菌被頭孢噻吩誘導(dǎo)后，ISEcp1轉(zhuǎn)座插入到blaCTX-M上游，且誘導(dǎo)后的志賀菌較誘導(dǎo)前對(duì)多種頭孢菌素耐藥水平顯著提高。
　　6.成功獲得重組質(zhì)粒pCTX、pISECTX，并將它們與pMD19-T空載體分別轉(zhuǎn)入DH5α感受

8、態(tài)細(xì)胞，獲得DH5α(pCTX)、DH5α(pISECTX)、DH5α(T)轉(zhuǎn)化子。對(duì)DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)插入序列測(cè)序發(fā)現(xiàn)該blaCTX-M基因?yàn)閎laCTX-M-55，其上游是ISEcp1含-35區(qū)和-10區(qū)啟動(dòng)子位點(diǎn)。
　　7.DH5α(pISECTX)克隆株blaCTX-M基因表達(dá)的相對(duì)含量顯著高于DH5α(pCTX)的相對(duì)含量。
　　8.DH5α(pISECTX)較DH5α(pCTX)對(duì)下

9、列頭孢菌素均從不耐藥到耐藥，包括頭孢噻吩、頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松，對(duì)頭孢吡肟雖沒達(dá)到耐藥水平，但DH5α(pISECTX)較DH5α(pCTX)對(duì)頭孢吡肟的最低抑菌濃度提高了32倍。
　　9.對(duì)DH5α(T)、DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)進(jìn)行ESBLs表型確證試驗(yàn)，判定只有DH5α(pISECTX)產(chǎn)ESBLs。
　　10.233株志賀菌株中，對(duì)頭孢噻吩、頭孢唑啉耐藥檢出率較高分別為35

10、.2％和28.3％，對(duì)頭孢呋辛鈉耐藥檢出率為13.7％，對(duì)抗生素頭孢噻肟的耐藥檢出率12.9％高于頭孢他啶9.0％，對(duì)頭孢吡肟的耐藥檢出率最低，為5.2％。共有92株對(duì)1種或1種以上頭孢菌素產(chǎn)生耐藥。志賀菌耐藥譜型分析顯示，志賀菌對(duì)6種頭孢菌素的耐藥譜型有24種。最常見的頭孢菌素耐藥譜型是頭孢噻吩、頭孢唑啉占35.87％。
　　11.1998～2001年及2003～2008年志賀菌頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟的耐藥檢出率有逐年上升的趨勢(shì)。

11、同時(shí)期，志賀菌ISEcp1和blaCTX-M的攜帶率也有逐年上升的趨勢(shì)。
　　12.志賀菌中基因標(biāo)記分布情況:
　　1)ISEcp1陽(yáng)性組志賀菌對(duì)頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢呋辛鈉及頭孢噻肟的耐藥檢出率高于ISEcp1陰性組志賀菌。
　　2)blaCTX-M陽(yáng)性組志賀菌對(duì)頭孢呋辛鈉及頭孢噻肟的耐藥檢出率高于blaCTX-M陰性組志賀菌。
　　3)ISECTX片段陽(yáng)性組志賀菌對(duì)頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢呋辛鈉及頭孢噻肟的

12、耐藥檢出率高于ISECTX片段陰性組志賀菌。
　　結(jié)論：
　　1.在持續(xù)的小劑量頭孢噻吩藥物的作用下，志賀菌對(duì)頭孢菌素類抗生素的敏感性能大大降低，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥。
　　2.頭孢噻吩誘導(dǎo)敏感志賀菌前后基因組序列發(fā)生改變，且誘導(dǎo)耐藥株比出發(fā)敏感株多一個(gè)己內(nèi)酰胺代謝通路，此代謝通路可能與誘導(dǎo)耐藥有關(guān)。
　　3.在外界頭孢菌素壓力下，ISEcp1可轉(zhuǎn)座插入到blaCTX-M上游，為blaCTX-M表達(dá)提供所需要的啟動(dòng)子