福氏志賀菌基因組分析及耐藥機理研究.pdf

1、志賀氏菌病又稱細菌性痢疾，是一種具有高度傳染性和嚴重危害性的腸道傳染病，嚴重危害人類的健康和生命安全，在我國流行的優(yōu)勢菌株為福氏志賀菌2a型，其主要感染人群為5歲以下的兒童和免疫障礙的人群。世界衛(wèi)生組織推薦治療菌痢的首選藥物為環(huán)丙沙星，其次為頭抱曲松和匹美西林。本文采用臨床常用的環(huán)丙沙星、頭孢曲松和一種廣譜抗生素四環(huán)素分別誘導(dǎo)福氏志賀菌301株產(chǎn)生耐藥性，然后對菌株基因組測序，從而在基因組水平研究其耐藥機理。
　　1.根據(jù)Gene

2、Bank中發(fā)表的各志賀菌血清型特性基因ipaH(M32063)、gtrⅡ(AF021347)、gtrⅩ(L05001)、R002(AF250878)組成多重PCR體系，用于福氏志賀菌301株的驗證，能夠在多種細菌中快速、靈敏、特異的檢測出福氏志賀菌301株，不僅為之后實驗過程中保證菌株不受污染奠定了基礎(chǔ)，同時創(chuàng)造出了一種快速檢測分離志賀菌的有效方法。
　　2.利用一系列梯度濃度的環(huán)丙沙星、頭孢曲松、四環(huán)素對福氏志賀菌標(biāo)準株分別誘導(dǎo)

3、后其MIC分別為64μg/mL、64μg/mL、128μg/mL，均已達到耐藥水平。依據(jù)各抗生素誘導(dǎo)菌株MIC增長曲線選定福氏志賀菌301株標(biāo)準菌進行de novo測序，環(huán)丙沙星、四環(huán)素誘導(dǎo)的5、7、10代和頭孢曲松誘導(dǎo)的5、9、10代進行重測序。
　　3.de novo測序共產(chǎn)生732Mb數(shù)據(jù)，組裝后經(jīng)基因組組分分析得到4，832個基因，78個串聯(lián)重復(fù)序列，44個小衛(wèi)星序列，11個微衛(wèi)星序列，102個tRNA和16個rRNA。然

4、后采用GO、KEGG、Swiss-Prot、COG、NR、Tremble、CAZy、ARDB、VFDB、PHI、T3SS等多個數(shù)據(jù)庫對得到的4832個基因序列進行基因名、基因功能注釋和分類，針對各數(shù)據(jù)庫特征，綜合利用各數(shù)據(jù)庫的優(yōu)點完善實驗研究。利用de novo測序數(shù)據(jù)與已公布的福氏志賀菌301株基因組(NC_004337)比對檢測到317個SNP位點，包括74個同義突變;237個非同義突變和6個無義突變。
　　4.重測序序列與d

5、e novo序列比對后發(fā)現(xiàn)多個突變位點，即metG基因位點284497在TC-2、CIP-2、CRO-3中由T<->G的突變;gyrB基因位點1953446在CIP-2中由C<->A的突變;gydA基因位點670796在CIP-7中由A<->C的突變;rob基因位點335049在CIP-10中由G<->A的突變;narX基因位點1072783在CRO-8中由A<->G的突變。以及間區(qū)位點1538933在CIP3、CRO3、TC3中由A<

6、->T;1538929在CIP5、CR04、TC5中由G<->A;1538924在CIP8、CRO8、TC5中由G<->C。
　　5.對共有的突變基因metG（甲硫氨酰tRNA合成酶）功能注釋發(fā)現(xiàn)，metG主要影響甲硫氨酸的活化與轉(zhuǎn)移，且影響其他氨基酸的活化，在KEGG途徑注釋發(fā)現(xiàn)metG最終影響蛋白質(zhì)的合成。間區(qū)突變會影響酞酰脯氨酰順反異構(gòu)酶ppiA的功能。研究表明metG和ppiA基因突變不僅影響蛋白質(zhì)的合成，而且還是一個潛在