microRNA-30c通過(guò)調(diào)節(jié)自噬參與調(diào)控糖尿病心肌病機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　糖尿病(diabetesmillitus,DM)是當(dāng)今威脅人類(lèi)健康的重大疾病。研究指出,現(xiàn)在全世界現(xiàn)有糖尿病患者2.85億,預(yù)計(jì)到2030年,糖尿病的患病人數(shù)將幾乎是現(xiàn)在的兩倍。心血管并發(fā)癥是糖尿病患者致殘或致死的首要原因。其中,糖尿病獨(dú)立于高血壓、心臟瓣膜疾病、冠心病和及其他心臟病所導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常,即糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy)越來(lái)越受到研究者重視。研究者們相繼發(fā)現(xiàn)

2、脂質(zhì)毒性(lipotoxicity)、糖毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)紊亂、氧化應(yīng)激增強(qiáng)、代謝底物轉(zhuǎn)變、線(xiàn)粒體功能失常、炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERstress)等都是參與2型糖尿病心肌病的致病機(jī)制。其中脂質(zhì)毒性對(duì)心臟功能和結(jié)構(gòu)的損傷是糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但確切的分子機(jī)制還不甚明了。最近有研究指出,microRNA和自噬都參與胰島素抵抗時(shí)心臟病變過(guò)程,為我們對(duì)糖尿病心肌病的分子機(jī)制研究提

3、供了新的視角。
　　微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi),22-23個(gè)堿基長(zhǎng)度的非編碼單鏈RNA。MiRNAs通過(guò)與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslatedregion,3’UTR)特異性結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。大量的研究表明miRNAs參與機(jī)體的各種生命進(jìn)程;同時(shí),miRNAs功能異常參與各種疾病過(guò)程。近年來(lái)的研究表明,miRNAs,尤其是心臟高豐度表達(dá)的miRNA

4、s,在各種心臟病發(fā)病機(jī)制中扮演著重要作用。研究人員通過(guò)在心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)這些miRNAs,導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生肥大或體積減小,揭示了miRNA在心肌肥厚、心室重構(gòu)等病理生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。然而miRNAs在糖尿病及其心血管并發(fā)癥中的作用還不是很明確。
　　自噬是一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)成分降解再利用的保守進(jìn)化過(guò)程,通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽命蛋白或損傷蛋白及細(xì)胞器的降解,自噬維持著細(xì)胞生存。正常情況下,心臟低水平自噬是一種細(xì)胞應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制;然而,自噬過(guò)

5、度也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。最近有研究指出,在果糖誘導(dǎo)胰島素抵抗的小鼠模型中,自噬的激活與心肌細(xì)胞過(guò)氧化產(chǎn)物增多、纖維化及細(xì)胞死亡有關(guān),從而參與形成心臟胰島素抵抗,提示自噬在糖尿病心肌病致病機(jī)制中扮演重要角色。此外最近關(guān)于miR-30a參與調(diào)控自噬的研究引起廣泛關(guān)注,說(shuō)明miRNAs在自噬的調(diào)控中起著重要作用。
　　MiR-30家族是在心肌細(xì)胞高豐度表達(dá)的miRNAs之一。過(guò)去實(shí)驗(yàn)證明,miR-30參與調(diào)節(jié)心肌肥大、心室重塑、心肌纖維化等

6、一系列心臟功能異常的致病過(guò)程。但是miR-30c在糖尿病時(shí)心臟中的作用還不清楚。此外最近關(guān)于miR-30a參與調(diào)控自噬的研究引起廣泛關(guān)注,說(shuō)明miRNAs在自噬的調(diào)控中起著重要作用。miR-30c、自噬及糖尿病心肌病之間的調(diào)節(jié)關(guān)系啟發(fā)我們探究:miR-30c是否參與了2型糖尿病的病理過(guò)程?如果參與,miR-30c是否是通過(guò)調(diào)節(jié)自噬參與了糖尿病心肌病致病過(guò)程?因此,我們圍繞假設(shè),展開(kāi)相關(guān)研究,試圖從miRNAs的角度尋找新的糖尿病心肌病的

7、發(fā)病機(jī)制和治療方案。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　運(yùn)用real-timePCR對(duì)2型糖尿病db/db小鼠心肌和正常對(duì)照C57BL/Ks小鼠心肌分別進(jìn)行檢測(cè),從中了解miR-30c是否存在差異型表達(dá)。
　　利用western-blot技術(shù),在蛋白水平檢測(cè)自噬強(qiáng)度在db/db小鼠心肌中相對(duì)于正常對(duì)照C57BL/Ks小鼠心肌是否有所改變。
　　用高濃度FFAs培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)miR-30c及自噬發(fā)生受FF

8、As調(diào)控。
　　利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-30c的作用靶點(diǎn),將挑選出的預(yù)測(cè)的靶mRNA的3’UTR區(qū)克隆至pMIR-Report載體,運(yùn)用熒光報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證靶點(diǎn),并利用western-blot技術(shù)再次驗(yàn)證靶點(diǎn)。
　　利用我們特有的心肌特異性病毒表達(dá)載體recombinantadeno-associatedvirusvector9(rAAV9),將miR-30c、anti-miR-30c及靶mRNA分別包裝至病毒表達(dá)載體

9、,并檢測(cè)滴度及轉(zhuǎn)染效率。
　　將上述rAAV載體介導(dǎo)體內(nèi)表達(dá),在db/db小鼠心肌中差異性表達(dá)miR-30c,并將靶mRNA回復(fù),驗(yàn)證miR-30c的載體沉默效應(yīng)。
　　通過(guò)小鼠心臟超聲和血流動(dòng)力學(xué)分析檢測(cè)差異表達(dá)miR-30c是否影響小鼠心臟功能同時(shí)western-blot和電鏡檢測(cè)差異表達(dá)miR-30c對(duì)自噬通路的影響。
　　利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-30c啟動(dòng)子區(qū)的上游調(diào)控靶點(diǎn),miR-30c的5’-prom

10、oter區(qū)克隆至pGL3-Report載體,運(yùn)用熒光報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證靶點(diǎn),并利用western-blot技術(shù)再次驗(yàn)證上游調(diào)控。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.2型糖尿病小鼠心肌組織中差異性表達(dá)miR-30c通過(guò)real-timePCR檢測(cè)證實(shí)了miR-30c的差異性表達(dá)。驗(yàn)證相對(duì)于正常對(duì)照,在2型糖尿病心肌病中miR-30c表達(dá)下調(diào)。
　　2.2型糖尿病小鼠心肌組織中自噬增強(qiáng)利用western-blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Bec

11、lin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá),證明相對(duì)于正常對(duì)照,2型糖尿病小鼠心肌中自噬增強(qiáng)。
　　3.高濃度FFAs培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞miR-30c下調(diào)、自噬發(fā)生增強(qiáng)高水平FFAs培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9c2,相對(duì)于未處理對(duì)照組,real-timePCR檢測(cè)表明miR-30c明顯下調(diào);western-blot證明FFAs誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)
　　4.miR-30c靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及驗(yàn)證利用TARGETSCAN預(yù)測(cè)分析網(wǎng)站對(duì)miR-30c的作用靶mRNAs進(jìn)

12、行預(yù)測(cè)分析,篩選出Beclin-1是miR-30c可能的靶點(diǎn)mRNA,將其3’UTR區(qū)序列構(gòu)建至pMIR-Report載體,通過(guò)熒光報(bào)告基因技術(shù)結(jié)果提示Belcin-1為miR-30c的作用靶基因,同時(shí)采用western-blot進(jìn)行了蛋白水平驗(yàn)證。
　　5.rAAV-miR-30c、rAAV-anti-miR-30c及rAAV-Beclin-1病毒包裝及rAAV載體介導(dǎo)miR-30c體內(nèi)差異性表達(dá)及其對(duì)2型糖尿病心臟功能調(diào)節(jié)分析

13、及對(duì)自噬的影響
　　采用rAAV9包裝系統(tǒng),分別包裝rAAV-miR-30c、rAAV-anti-miR-30c及rAAV-Beclin-1病毒,real-timePCR檢測(cè)病毒滴度,同時(shí)轉(zhuǎn)染rAAV-GFP檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　將db/db小鼠尾靜脈分別注射rAAV-miR-30c、rAAV-anti-miR-30c,使miR-30c在心肌中差異性表達(dá)。并另外注射rAAV-Beclin-1病毒逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-30c對(duì)Bec

14、lin-1的抑制效應(yīng)。小鼠心臟超聲和血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),相對(duì)于對(duì)照組,rAAV-miR-30c組心功能增強(qiáng)。Western-blot發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-30c使Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白水平降低,提示自噬降低,并通過(guò)電鏡進(jìn)一步驗(yàn)證過(guò)表達(dá)rAAV-miR-30c使自噬小體減少。但rAAV-Beclin-1回復(fù)后,逆轉(zhuǎn)了miR-30c的效應(yīng),自噬減弱。同時(shí),rAAV-anti-miR-30c組心功能受損,自噬增強(qiáng)。
　　6.MiR

15、-30c上游表達(dá)調(diào)控利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出NF-κB調(diào)控miR-30c啟動(dòng)子區(qū),miR-30c的5’-promoter區(qū)克隆至pGL3-Report載體,運(yùn)用報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證NF-κB對(duì)miR-30c啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控,并利用real-timePCR檢測(cè)再次驗(yàn)證NF-κB上游調(diào)控miR-30c表達(dá)。
　　7.db/db小鼠心臟中NF-κB表達(dá)研究通過(guò)對(duì)db/db小鼠心臟組織的免疫組化檢測(cè),發(fā)現(xiàn)NF-κB表達(dá)降低;同時(shí)其抑制分子IκB

16、-α表達(dá)增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)2型糖尿病心肌病動(dòng)物模型db/db小鼠心肌組織中的差異性表達(dá)miR-30c,利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù),對(duì)miR-30c在體內(nèi)、體外對(duì)糖尿病時(shí)心肌細(xì)胞的作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究,得出以下結(jié)論:
　　1.2型糖尿病小鼠db/db心肌細(xì)胞中或高濃度FFAs誘導(dǎo)心肌細(xì)胞時(shí),miR-30c表達(dá)下調(diào),自噬增強(qiáng);
　　2.miR-30c能通過(guò)沉默Beclin-1