人胚胎干細胞早期培養(yǎng)過程DLK1-DIO3印記區(qū)和X染色體失活狀態(tài)不穩(wěn)定性研究.pdf

1、第一章早期培養(yǎng)對人類胚胎干細胞(hESCs)遺傳穩(wěn)定和基因表達的影響
　　目的:既往的研究發(fā)現(xiàn)在長期培養(yǎng)的hESCs(＞P30)中會發(fā)生一些遺傳和表觀遺傳的改變，然而，對于P30以前是否也發(fā)生了一些改變目前知之甚少，我們的研究目的在于利用我們胚胎干細胞庫的豐富資源，評估hESCs在分離后的早期培養(yǎng)過程（20代以前）的遺傳學改變和基因表達的改變。
　　材料和方法:利用我們胚胎干細胞庫的胚胎干細胞資源，分別選取核型正常的分離初始

2、期（P4-P9）和早期(P20-P30) hESCs，其中5株進行SNP芯片用于分析遺傳變化，12株行全基因組表達譜芯片用于分析基因表達變化。
　　結(jié)果:從我們選取的細胞庫中核型正常，并已完成各項檢查的12株hESCs的初始期和早期未分化樣本進行的以上實驗可得到以下結(jié)果(1)SNP芯片分析結(jié)果可知，有一些小片段的缺失和重復，這些片段的平均大小約為100 kb，且不存在規(guī)律性的改變。(2)從表達譜的分析來看，在兩個階段的樣本間平均僅

3、有0.10±0.09％的基因（檢測的38500基因中有12-136個發(fā)生改變）發(fā)生顯著性改變(＞2-fold，t-test，P＜0.05)。(3)兩個階段樣本間共同的的變化是早期女性樣本中XIST基因的沉默和早期大部分樣本中DLK1-DIO3印記區(qū)域中相關(guān)轉(zhuǎn)錄子的沉默，以MEG3，SNORD114-3為代表。
　　結(jié)論:在胚胎干細胞培養(yǎng)的早期階段，遺傳物質(zhì)未發(fā)生顯著的規(guī)律性改變，而從轉(zhuǎn)錄水平來看，基因表達整體變化較小，但存在共同的

4、差異:XIST基因和DLK1-DIO3印記區(qū)域在早期hESCs中的沉默。
　　關(guān)鍵詞:人胚胎干細胞;早期培養(yǎng);遺傳;XIST基因;DLK1-DIO3印記區(qū)
　　第二章生理氧培養(yǎng)能阻止hESCs早期培養(yǎng)階段普遍發(fā)生的DLK1-DIO3印記區(qū)的異常沉默
　　目的:DLK1-DIO3印記區(qū)是一個進化上保守的印記區(qū)域，位于人類14號染色體(14q32)，在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠iPS細胞重編程過程易發(fā)生Dlk1-Dio3印記

5、區(qū)的異常沉默，其沉默損害了iPS在四倍體囊胚補償實驗中形成完全iPS來源的成體小鼠的能力。基于第一章中DLK1-DIO3印記區(qū)在早期hESCs中易發(fā)生沉默的現(xiàn)象，回答以下問題:1， DLK1-DIO3印記區(qū)編碼的其他小RNA是否受MEG3沉默的影響，2，確定第一章中DLK1-DIO3印記區(qū)的沉默是一種普遍現(xiàn)象還是個例，3，該印記區(qū)沉默的調(diào)控機制，4，初始期的hESCs是否是一種正常的印記狀態(tài)，5，沉默是什么原因引起的以及對hESCs分化

6、能力是否有影響？
　　材料和方法:1，在配對的初始期和早期hESCs中，采用small RNA深度測序方法對DLK1-DIO3印記區(qū)編碼的其他小RNA(包括miRNAs和snoRNAs)的表達情況進行了分析。2，利用Real-time PCR方法檢測了細胞庫中更多細胞系中DLK1-DIO3印記區(qū)的表達狀態(tài)，同時利用GEO數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學評估了國際上常用的hESCs及一些hiPSC系中該印記區(qū)的表達狀態(tài)。3，DLK1-DIO3

7、印記區(qū)受DLK1和MEG3間的基因間差異甲基化區(qū)域和MEG3啟動子區(qū)域的差異甲基化區(qū)域所調(diào)控，采用亞硫酸鹽測序的方法對這些調(diào)控區(qū)域的甲基化狀態(tài)進行了評估。4，利用MEG3外顯子區(qū)域的SNP位點，通過對表達產(chǎn)物進行sanger測序，對MEG3的表達模式（單等位或雙等位）進行了分析。5，針對第一章中確定發(fā)生沉默的細胞系，采用體內(nèi)外分化實驗（EB和畸胎瘤實驗）對沉默前后的hESCs進行了分化能力的分析，并分析了分化能否逆轉(zhuǎn)MEG3的沉默。6，

8、針對DLK1-DIO3在部分細胞系中不發(fā)生沉默著手，提出了氧濃度可能是影響該印記區(qū)活化狀態(tài)的關(guān)鍵因素的推斷，通過在生理氧分離、培養(yǎng)新的細胞系檢測MEG3活性和相關(guān)調(diào)控區(qū)域的甲基化狀態(tài)對該推斷進行了驗證。7，將大氣氧條件分離的hESCs在初始期階段轉(zhuǎn)入生理氧條件長期培養(yǎng)，Real-timePCR檢測分析其能否阻止MEG3的發(fā)生沉默。
　　結(jié)果:1，在hESCs早期培養(yǎng)過程，DLK1-DIO3印記區(qū)的沉默還包括該區(qū)域編碼的miRNAs

9、和snoRNAs的沉默。2，從我們實驗室和國際上其他實驗室更多多能性細胞系的分析結(jié)果可知，DLK1-DIO3印記區(qū)的沉默是多能性干細胞（包括hESCs和iPS）在常規(guī)培養(yǎng)條件下極其常見的表觀遺傳改變。3，MEG3的沉默伴隨著MEG3啟動子區(qū)域和MEG3、DLK1基因間調(diào)控區(qū)域的高度甲基化。4，hESCs培養(yǎng)初始期是單等位表達模式，為正常的印記狀態(tài)。5，從hESCs分化能力來看，該印記區(qū)沉默后，仍具有體內(nèi)外多向分化潛能，但分化后，沉默的M

10、EG3不會被激活;6，大氣氧的分離和培養(yǎng)是引起該印記區(qū)沉默的關(guān)鍵因素，生理氧分離和培養(yǎng)能維持該印記區(qū)的活化狀態(tài)。7，大氣氧濃度分離的初始期hESCs轉(zhuǎn)入生理氧濃度培養(yǎng)不能逆轉(zhuǎn)MEG3的沉默。
　　結(jié)論:在我們的研究中揭示了一個hESCs在早期培養(yǎng)過程經(jīng)常發(fā)生的表觀異?，F(xiàn)象-DLK1-DIO3印記區(qū)的異常沉默，這種沉默不光發(fā)生在我們細胞庫中的細胞，國際上其他其他實驗室的一些多能性細胞系包括hES和hiPS也經(jīng)常發(fā)生這種沉默，其沉默伴

11、隨著調(diào)控區(qū)域的高度甲基化，DLK1-DIO3沉默在培養(yǎng)過程不可逆且會傳遞給分化的子代細胞。進一步，我們的研究發(fā)現(xiàn)20％的氧是引起這種改變的主要原因，把胚胎干細胞維持在5％濃度下分離、培養(yǎng)可以阻止這種改變的發(fā)生。我們的研究強調(diào)從最初始期開始培養(yǎng)條件對hESCs表觀穩(wěn)定性就有重要作用。
　　關(guān)鍵詞:DLK1-DIO3印記區(qū);異常沉默;5％生理氧;20％大氣氧
　　第三章追溯人胚胎干細胞分離和早期培養(yǎng)過程X染色體失活(XCI)動態(tài)

12、變化
　　目的:X染色體失活(XCI)是女性細胞為了維持X連鎖基因劑量補償所必需的，有一些研究報道了長期培養(yǎng)的女性胚胎干細胞系中存在多種XCI狀態(tài)。同時，對于早期胚胎中的XCI狀態(tài)仍存在爭議。XIST是XCI啟動和維持的關(guān)鍵基因，我們的目的一方面在于評估在培養(yǎng)早期階段XCI的變化和其對hESCs的影響以及分離過程X染色體失活狀態(tài)，另一方面我們探討了氧濃度對XCI狀態(tài)的影響。
　　材料和方法:1，采用XISY基因Real-ti

13、me PCR檢測結(jié)合H3K27me3免疫細胞化學判斷X染色體失活標記在hESCs和其子代細胞中的表達情況;2，從X染色體轉(zhuǎn)錄活性和遲復制狀態(tài)判斷整條X染色體的活性;3，通過芯片結(jié)果比較兩個階段X染色體連鎖基因的表達，評判X連鎖基因表達變化;4，通過直接測序的方法:X連鎖基因的表達情況為單等位表達還是雙等位表達來評估X染色體失活模式;5，通過在生理氧條件下重新分離、培養(yǎng)hESCs，評估氧濃度為XCI狀態(tài)的影響;6，通過XCI標記H3K27

14、me3點狀聚集和多能性標記OCT4免疫細胞化學共染評判hESCs分離過程X染色體失活的狀態(tài)。
　　結(jié)果:1，在培養(yǎng)的初始期階段，女性hESCs表達失活標記XIST和H3K27me3的點狀聚集，在早期培養(yǎng)過程，XIST逐漸下調(diào)，H3K27me3點狀聚集也逐步消失，至P20代以后，標記幾乎完全丟失，這些標記的表達方式會傳遞給分化的子代細胞。2，從整條X染色體的轉(zhuǎn)錄活性來看，初始期和早期hESCs都擁有一條X染色體無轉(zhuǎn)錄活性，處于遲復制

15、狀態(tài)。3，從X染色體連鎖基因的轉(zhuǎn)錄水平來看，在這個標記丟失的過程，約4％的X連鎖基因出現(xiàn)了1.5-2倍上調(diào)。4，從失活模式來看，初始期hESCs擁有一條隨機失活的X染色體，而隨著培養(yǎng)的進行，早期hESCs中的失活模式轉(zhuǎn)變成了完全的偏斜失活模式。5，大部分生理氧條件分離、培養(yǎng)的女性hESCs在早期培養(yǎng)階段能維持正常的XCI狀態(tài)。6，在hESCs分離過程，在囊胚階段，女性樣本有一條失活的X染色體，而在分離過程，首先會出現(xiàn)X染色體的重新活化（

16、約為受精后第8天），隨后又很快啟動一條X染色體的失活（受精后第10天）。
　　結(jié)論:在目前的分離、培養(yǎng)體系，女性hESCs在早期培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)X染色體失活的動態(tài)變化，即從擁有一條隨機失活的X染色體到一條偏斜失活且部分基因活化的X染色體，可知目前常規(guī)應(yīng)用的大氣氧培養(yǎng)條件有待進一步改進，而生理氧培養(yǎng)有利于女性hESCs維持正常的XCI狀態(tài)，;人類早期胚胎擁有一條失活的X染色體，在分離過程，會瞬時的出現(xiàn)兩條活化的階段，隨后啟動XCI，