Mps1突變體在染色體不穩(wěn)定性中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：目前腫瘤的基因研究已取得了令人矚目的進(jìn)展，重要的癌基因激活是主要原因之一。RAS/RAF/ERK信號通路涉及了多個癌基因的激活，與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)?？蒲腥藛T已在人類許多腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)B-RAF基因的突變，如70％的皮膚癌，50%的甲狀腺癌，20%的結(jié)腸癌等惡性腫瘤中都檢測到B-RAF基因的突變。其中大約90%的點突變?yōu)門1796A，該點突變導(dǎo)致纈氨酸被谷氨酸所代替(V600E)，稱B-RAFV600E。2008年，有研

2、究首次報道了B-RAF基因在有絲分裂期的新作用，該基因突變后可導(dǎo)致人皮膚癌細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和永生化上皮細(xì)胞出現(xiàn)紡錘體異常、染色體不穩(wěn)定性及非整倍體細(xì)胞出現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上課題組前期又鑒定出癌基因B-RAFV600E新的作用底物—紡錘體檢測點激酶Mps1，二者在有絲分裂期均定位于著絲粒和中心體處，B-RAFV600E主要通過增強(qiáng)Mps1的穩(wěn)定性而使Mps1蛋白水平以及激酶活性顯著增加，導(dǎo)致紡錘體檢測點過度激活。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，癌基因B-R

3、AFV600E通過磷酸化修飾紡錘體監(jiān)測點激酶Mps1-S281、S436、S821,分別影響Mps1激酶的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、激酶活性等。前期研究發(fā)現(xiàn)pS281-Mps1通過抑制由APC/CCdc20介導(dǎo)的Mps1蛋白泛素-蛋白酶體降解途徑而增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性，導(dǎo)致過量Mps1在中心體處聚積。那么B-RAFV600E磷酸化修飾Mps1導(dǎo)致Mps1突變體異常穩(wěn)定，是否影響腫瘤細(xì)胞中心體復(fù)制、紡錘體檢測點功能？這是一個值得探討的問題。
　　研

4、究目的：闡明Mps1突變體對中心體復(fù)制、紡錘體檢測點功能的影響，結(jié)合前期研究闡述B-RAFV600E導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中心體復(fù)制、紡錘體檢測點功能異常機(jī)制，最終明確癌基因B-RAFV600E在腫瘤細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性中的分子機(jī)制。
　　研究方法：為明確Mps1突變體對中心體復(fù)制、紡錘體檢測點功能的影響，我們主要從以下幾方面進(jìn)行研究：
　　(1)采用HU-arrestassay將SK-MEL31細(xì)胞阻斷于有絲分裂S期，免疫熒光技術(shù)分析

5、Mps1突變體對中心體復(fù)制的影響。
　　(2)以MBP作為底物進(jìn)行激酶活性檢測，Mps1突變體對Mps1激酶活性的影響。
　　(3)Metaphase-spreadsanalysis分析Mps1突變體對染色體不穩(wěn)定性的影響。
　　(4)購買皮膚癌組織芯片(ME207)，以p-ERK（反映B-RAFV600E激酶活性）、p-S281Mps1抗體做免疫組化分析B-RAFV600E信號通路與pS281-Mps1在皮膚癌組織芯

6、片中的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：(1)采用HU-arrestassay將SK-MEL31細(xì)胞阻斷于有絲分裂S期，免疫熒光技術(shù)分析表達(dá)WT-Mps1、S281E、S436E、S821E、EEE及AAA細(xì)胞中中心體數(shù)目的變化發(fā)現(xiàn)，與表達(dá)WT-Mps1、AAA的細(xì)胞相比表達(dá)S281E、S436E、EEE的細(xì)胞中心體復(fù)制異常（n≥3）細(xì)胞比例顯著增高，依次為55%、30%、70%。
　　(2)以MBP作為底物，以kinase-dead

7、（KD即不具有激酶活性）作為對照，進(jìn)行激酶活性檢測，WT-Mps1有效磷酸化修飾MBP，而Mps1-KD則失活。S281E和S821E與野生型相比同樣具有激酶活性。然而，S281A和S821A的Mps1激酶活性減弱甚微，S436A卻顯著抑制了Mps1激酶活性，表明pS436-Mps1對Mps1激酶活性至關(guān)重要。S436E、EEE比WT-Mps1具有更高的激酶活性。
　　(3)以pBabe-puro-HA-Mps1-EEE逆轉(zhuǎn)錄病毒

8、顆粒感染Sbcl2細(xì)胞和SK-MEL31細(xì)胞，感染效率達(dá)90%以上。96h后，進(jìn)行metaphase-spreadsanalysis，結(jié)果表明，與空載體對照組相比，穩(wěn)定表達(dá)Mps1-EEE的Sbcl2細(xì)胞，SK-MEL31細(xì)胞染色體分離異常細(xì)胞比例顯著增高，其中，主要為多極紡錘體表型，其次亦有少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)lagging-chromosomes。免疫熒光結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)Mps1-EEE的Sbcl2細(xì)胞，SK-MEL31細(xì)胞中染色體數(shù)目大于

9、或小于46的細(xì)胞比例顯著增加，即非整倍體細(xì)胞。
　　(4)從USBiomax,Inc(Rockville,MD)購買皮膚癌組織芯片(ME207)，該芯片包括正常皮膚對照及皮膚癌不同分期組織。以p-ERK（反映B-RAFV600E激酶活性）、p-S281Mps1抗體做免疫組化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-MAPK陽性（包括陽性和強(qiáng)陽性）在正常皮膚組織（0%）、惡性黑色素瘤（48%）、轉(zhuǎn)移黑色素瘤（69%）比例依次顯著增高（P＜0.001）。同樣

10、pS281-Mps1陽性表達(dá)（包括陽性和強(qiáng)陽性）在正常皮膚組織（0%）、惡性黑色素瘤（54%）、轉(zhuǎn)移黑色素瘤（91%）比例依次顯著增高（P＜0.001）。并且我們發(fā)現(xiàn)顯示p-MAPK陽性的病例同時顯示pS281-Mps1陽性表達(dá)，反之亦然。提示二者在皮膚癌組織中顯著相關(guān)，并與臨床分期呈正相關(guān)（r＝0.25,P＝0.002,Spearmantest）。
　　結(jié)論：綜合以上結(jié)果表明癌基因B-RAFV600E通過磷酸化修飾有絲紡錘體監(jiān)測