Dlk1-Dio3印記區(qū)域內CGI-2調控基因表達的研究.pdf

1、Dlk1-Dio3印記基因簇位于小鼠的第十二號染色體末端（12qF1），以及人類的第14號染色體上(14q32)。該印記區(qū)域對胚胎和胎盤的生長發(fā)育起到重要的調控作用，還影響成體的新陳代謝和大腦的功能。且該區(qū)域內各基因表達在生長發(fā)育中呈現一個動態(tài)變化的過程。CGI-2位于該區(qū)域內miR-341和miR-1188附近，為該區(qū)域內首個被發(fā)現的母本甲基化而父本非甲基化的差異甲基化區(qū)域，且為結合CTCF并具有絕緣子活性的DNA功能原件。因此，本文

2、選取Dlk1-Dio3印記區(qū)域為研究對象，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術對CGI-2進行長片段的基因組刪除，在細胞水平上分析CGI-2敲除后其上下游基因的表達變化。
　　首先，本文對細胞系內Dlk1-Dio3印記區(qū)域中各基因表達水平進行分析，從而篩選出三株適合敲除實驗的細胞系。所選擇的三株細胞系分別為Dlk1-Dio3印記區(qū)域中各基因表達水平偏高的N2a、該印記區(qū)域中各基因表達水平較低的Hepa1-6以及非癌細胞系NIH3

3、T3。通過向導RNA預測網站設計出用于CRISPR/Cas9敲除實驗的兩對向導RNA，并且構建px330重組質粒。
　　其次，在N2a細胞中進行CGI-2敲除預實驗，選擇適合用于實驗的向導RNA。隨后，分別在N2a、Hepa1-6和NIH3T3三種細胞系中進行CGI-2的CRISPR/Cas9的基因敲除，在驗證敲除成功的前提下通過實時定量分析的方法判斷在CGI-2缺失的情況下Dlk1-Dio3印記區(qū)域內父母本基因的表達水平變化。其

4、結果顯示，敲除位點遠端的Dio3并沒有明顯的變化、Dlk1有不顯著的下調趨勢；位于次遠端的Mirg呈現出上調的趨勢，但在不同細胞系中其上調程度存在差異；而位于區(qū)域中間部分的Gtl2、Rtl1、Rian、Meg8、Irm和AB063319有顯著的上調趨勢。綜上可知，CGI-2的缺失會導致Dlk1-Dio3印記區(qū)域中各基因表達水平的變化，即CGI-2對該印記區(qū)域的表達具有調控作用。
　　最后，檢驗在刪除CGI-2和未刪除CGI-2的兩

5、種情況下Dlk1-Dio3印記區(qū)域內Dlk1-DMR、Gtl2-DMR、IG-DMR和CGI-1-DMR這四個差異甲基化區(qū)域的甲基化狀態(tài)。結果顯示，在刪除CGI-2和未刪除CGI-2的兩種情況這四個差異甲基化區(qū)域均為高甲基化狀態(tài)，即未發(fā)生改變。
　　綜上所述，CGI-2的缺失會導致其所在的Dlk1-Dio3印記區(qū)域內多種基因表達水平發(fā)生變化，且這種變化趨勢在不同細胞系中大致相同；CGI-2對該印記區(qū)域中基因表達的調控作用與該區(qū)域內