葒草苷對大鼠腦缺血再灌注損傷自噬作用及其JNK-ERK通路的研究.pdf

1、缺血性腦卒中是中國居民死亡的主要原因之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點，嚴重危害人類健康。臨床上治療腦缺血的主要方式是恢復血流供應，但血流恢復的同時又會引起再灌注腦損傷，因此受到醫(yī)學界廣泛的關注。腦缺血再灌注損傷過程中有許多機制的參與，如氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、線粒體損傷等，這些因素相互作用，引起一系列病理級聯(lián)反應，造成腦組織損傷，目前仍缺乏有效的治療手段。
　　隨著對自噬作用研究的不斷深入，從自噬角度探討藥物對腦

2、缺血再灌注損傷的作用及機制成為現(xiàn)代醫(yī)學領域研究的熱點。自噬是生命體特殊的分解代謝途徑，對維持細胞生存及穩(wěn)態(tài)有重要作用。正常生理狀態(tài)下，自噬處于較低的水平，當受到缺血或缺氧等條件刺激時被激活，研究表明自噬對細胞具有雙重作用，適度激活自噬可以保護細胞，而過度自噬可能會對細胞造成一定的損傷。目前，自噬的研究還不太成熟，其具體分子機制及信號通路仍未完全闡明。
　　葒草苷屬碳苷黃酮類單體，是中國傳統(tǒng)中藥金蓮花、葒草和竹葉的主要活性成分，臨床

3、上常用于治療冠心病、心絞痛、心血瘀阻等癥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葒草苷對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，可顯著降低大鼠腦梗死體積和改善缺血腦組織的病理形態(tài)結構，其保護作用機制是通過抗炎、抗氧化以及降低興奮性氨基酸的神經毒性實現(xiàn)的。但到目前為止，葒草苷是否通過干預自噬發(fā)揮對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用尚未研究。因此，本文從自噬角度研究葒草苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，并探討其參與的JNK/ERK信號通路，期望為葒草苷的臨床用藥提供

4、新的作用靶點。
　　本實驗采用改良的Longa線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，大鼠麻醉后使其右側大腦缺血，在缺血2h后進行再灌注，待大鼠蘇醒后進行神經功能評分。結果顯示，與假手術組相比，模型大鼠出現(xiàn)不能完全伸展手術對側前爪或向手術對側轉圈、傾倒等神經缺損癥狀，評分在1～3分左右，表明MCAO模型的成功建立。
　　1Beclin1與LC3在腦缺

5、血再灌大鼠腦缺血區(qū)的動態(tài)表達
　　大鼠隨機分為假手術組（Sham）、腦缺血再灌注(I/R)組，其中I/R組分為再灌注1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h各亞組，Sham組大鼠只分離頸總動脈，不插入栓線。各組大鼠分別于相應時間點斷頭取腦，利用免疫組織化學、實時熒光定量PCR和western-blot法，檢測不同再灌時間點大鼠缺血側腦皮層Beclin1與LC3的陽性細胞數(shù)、蛋白和mRNA的表達水平，以此選取合適的時間點做后

6、續(xù)實驗。
　　免疫組化結果表明，與Sham組相比，I/R組大鼠Beclin1與LC3的陽性細胞數(shù)均顯著增多(P＜0.05，P＜0.01)，再灌注開始1～6h增加緩慢，12h時陽性細胞最多，并且持續(xù)到24h，之后陽性細胞表達降低。實時熒光定量PCR結果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠Beclin1與LC3的mRNA表達水平均提高，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，且24h表達最高，24h之后兩者mRNA表達降低。We

7、stern-blot結果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠Beclin1與LC3的相對蛋白表達均增加，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，再灌注開始呈逐漸增加的趨勢，于再灌注24h達到峰值，之后LC3的表達維持在較高的水平，而Beclin1的表達有所降低。
　　2葒草苷對大鼠腦缺血再灌注損傷自噬作用的研究
　　大鼠隨機分為Sham組、I/R組、I/R+葒草苷給藥組(Ori)、I/R+葒草苷+雷帕霉素組（Ori+R

8、AP）、I/R+葒草苷+3-甲基腺嘌呤組(Ori+3-MA)。給藥方式為腹腔注射，大鼠于腦缺血再灌注24h，采用TTC染色檢測大鼠腦梗死體積;western-blot法檢測大鼠缺血側腦皮層目的蛋白Beclin1、LC3以及磷酸化的Akt和mTOR的表達水平。
　　TTC結果表明，與Sham組相比，I/R組大鼠腦梗死體積增加，具有顯著性差異(P＜0.01);Ori給藥后大鼠腦梗死體積顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);與Ori給

9、藥組相比，提前給予自噬誘導劑RAP組腦梗死體積有所增加(P＜0.05)，而給予自噬抑制劑3-MA組腦梗死體積降低（P＜0.05）。Western-blot結果顯示，與Sham組相比，I/R組自噬蛋白Beclin1和LC3以及p-Akt和p-mTOR的表達增多，具有顯著性差異(P＜0.01);Ori給藥后以上蛋白的表達均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);與Ori給藥組相比，提前給予自噬誘導劑RAP組自噬蛋白Beclin1和LC3以及

10、p-Akt表達顯著增加(P＜0.05)，而p-mTOR蛋白的表達無顯著性差異，給予自噬抑制劑3-MA組Beclin1、p-Akt和p-mTOR蛋白表達顯著降低(P＜0.05)，而LC3蛋白的表達變化不顯著。
　　3葒草苷對大鼠腦缺血再灌注損傷JNK/ERK信號通路的研究
　　大鼠隨機分為Sham組、I/R組、I/R+葒草苷組(Ori)、I/R+葒草苷+JNK抑制劑組(Ori+JNK)、I/R+葒草苷+ERK抑制劑組(Ori+

11、ERK)。利用western-blot法檢測大鼠腦缺血再灌注24h目的蛋白Beclin1、LC3以及磷酸化的JNK和ERK的表達水平。
　　實驗結果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠自噬蛋白Beclin1、LC3以及p-ERK和p-JNK表達增多，具有顯著性差異(P＜0.01);與I/R組相比，Ori給藥后以上蛋白的表達均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);與Ori給藥組相比，給予JNK抑制劑組自噬蛋白Beclin1和LC3