基因轉(zhuǎn)染RP105抑制TLR4對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護及機制研究.pdf

1、　　目的：本項目通過構(gòu)建攜帶RP105基因的復制缺陷型重組腺病毒載體,間接冠脈在體轉(zhuǎn)染大鼠心肌,使RP105在心肌組織高表達,在大鼠在體心臟缺血再灌注模型中,以TLR-4信號通路為切入點,從基因表達、蛋白合成等多個層次研究RP105對心肌缺血再灌注損傷的保護作用,探討其分子機制。
　　方法： SPF級雄性SD大鼠40只,隨機分為4組(n=10)：生理鹽水+假手術(shù)組(Sham組,只穿線不結(jié)扎)、生理鹽水+缺血再灌注組(I/R組)

2、、Ad-RP105+ 缺血再灌注組(Ad-R組)、Ad-GFP+缺血再灌注組(Ad-G組)。重組腺病毒間接冠狀動脈轉(zhuǎn)染大鼠心肌,3d后建立心肌缺血再灌注模型。術(shù)后2h空氣栓塞法處死大鼠,采用光鏡觀察心肌組織的病理形態(tài)學改變；Evans blue和TTC雙染法估測心肌梗死面積；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定心肌TNF-α和IL-6的含量；Real-time PCR和Western blot檢測心肌RP105、TLR-4、MyD88、

3、NF-κB mRNA水平和蛋白表達情況。
　　結(jié)果：(1)采用攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒(Ad-GFP)成功轉(zhuǎn)染大鼠在體心肌,結(jié)果顯示,大鼠生存狀態(tài)良好,心肌轉(zhuǎn)染效率達91.5%。(2)光鏡結(jié)果顯示,Sham組心肌超微結(jié)構(gòu)及組織形態(tài)正常；IR組與Ad-G組心肌損害嚴重,而經(jīng)目的基因RP105處理過的Ad-R組心肌變性壞死得到顯著改善。(3)與IR組相比,Ad-R組心肌梗死面積明顯減少(41.3±1.5%vs 26.7±1

4、.3%, P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義；G組心肌梗死面積(39.9±1.2%)變化并無統(tǒng)計學意義。(4) 與Sham組相比,Ad-R組RP105 mRNA及蛋白表達均顯著增加(4.080 vs 1, 0.374 vs 0.149, P<0.05),而在I/R組與Ad-G組,其表達明顯下調(diào),P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。(5)與Sham組比較,缺血再灌注后各組心肌組織中TLR-4、MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表達均增加,其

5、中I/R組與Ad-G組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義；與缺血再灌注組IR組比較,Ad-R組顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義。(6)構(gòu)建缺血再灌注損傷模型后,心肌組織中TNF-α和IL-6表達水平升高, IR組與Ad-G組較Sham組顯著上升(P<0.05)；與IR組相比,Ad-R組心肌組織中TNF-α和IL-6表達水平受到一定抑制(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：(1) 復制缺陷型腺病毒對于大鼠生理功能并無明顯影響,安全有

6、效；(2) 構(gòu)建攜帶有目的基因RP105的復制缺陷型病毒,進行大鼠在體心肌轉(zhuǎn)染,可顯著提高心肌組織中RP105mRNA及蛋白表達； (3) 心肌細胞RP105高表達,可顯著減輕心肌缺血再灌注損傷；(4)TLR-4信號通路在大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中被激活,心肌組織TLR-4、MyD88、NF-κB基因及蛋白表達水平顯著升高,并分泌TNF-α和IL-6炎性因子介導炎癥級聯(lián)反應(yīng),參與缺血再灌注損傷發(fā)生的病理生理過程；(5) RP105可能