豬圓環(huán)病毒2型的檢測及皂苷類化合物對核酸疫苗的免疫增強作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、豬圓環(huán)病毒(PCV)為無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒,屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,分為1型(PCV1)和2型(PCV2)。PCV2與近年來發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)密切相關(guān),還常和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)等混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。迄今還沒有可以有效控制PCV2感染的方法。本文從PCV2的PCR檢測、序列分析及其與PRRSV混合感染的診斷、皂苷類化合物TSA和TSB對PCV2基因疫

2、苗的免疫佐劑作用等方面進行了研究,研究結(jié)果對于深入探索PCV2感染的有效控制方法具有較為重要的意義。1豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測及其ORF2序列分析
   建立了一種檢測圓環(huán)病毒2型(PCV2)的PCR方法。根據(jù)GenBank上的基因序列,針對ORF2保守區(qū)設(shè)計一對引物,用這對引物對臨床上疑似多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的組織樣品進行檢測,PCV2陽性的病料中可以擴增出一條692bp的特異性條帶,對其它病原的檢測結(jié)果為陰性。敏感

3、性測定結(jié)果表明,該PCR方法可以檢測出3.3×10-2μg/ml PCV2 DNA。該方法的建立對于臨床上進行PMWS的診斷具有重要意義。
   根據(jù)PCV2 ORF2基因序列設(shè)計一對引物,對11頭PMWS可疑病豬病料的進行PCR擴增,產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上,得到pT-ORF2。測序后進行比較,結(jié)果顯示核苷酸同源性為93.3%-100%,氨基酸同源性為91.5%-99.6%。這些基因序列同其它國內(nèi)(外)PCV2的ORF2

4、序列比較顯示,核苷酸和氨基酸的同源性分別為90%-100%和89.3%-99.6%。分子進化分析結(jié)果表明,國內(nèi)流行的PCV2可以分為3群,10個毒株的序列與其它大多數(shù)國內(nèi)毒株和法國毒株形成一個比較大的群,只有1株和國內(nèi)一些毒株以及荷蘭毒株形成一個群,只有少數(shù)國內(nèi)的PCV2與美國、德國、日本、西班牙毒株形成一個小分支。2豬圓環(huán)病毒2型與豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征混合感染的診斷
   已有資料表明,PCV2單獨感染導(dǎo)致的疾病不會造成大

5、批豬發(fā)病或死亡。但是PCV2可以破壞免疫系統(tǒng),容易繼發(fā)其它一些病原,如豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟,使疾病復(fù)雜化,病情加重,死亡率升高。
   2001年杭州地區(qū)有三個規(guī)?;i場陸續(xù)發(fā)生仔豬腹瀉、保育豬呼吸困難,剖檢發(fā)現(xiàn)肺部橡皮樣,全身淋巴結(jié)水腫、部分豬脾臟邊緣梗死,發(fā)病率、死亡率很高。我們設(shè)計了針對PRRSV、PCV2的特異性引物,進行RT-PCR或PCR檢測,分別應(yīng)用偽狂犬(PR)鑒別試劑盒檢測和免疫熒光法檢測PRV和CSFV,

6、經(jīng)過比較全面的檢查發(fā)現(xiàn)這些豬為PCV2合并PRRSV’或CSFV感染。3豬圓環(huán)病毒2型和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的熒光定量PCR檢測
   建立了基于SYBR Green檢測PCV2和PRRSV的熒光定量PCR方法。對PCV2和PRRSV的檢測下限和上限分別為103和1011拷貝;特異性比較好,不與PCV1、偽狂犬、細小病毒、傳染性胃腸炎病毒發(fā)生非特異性反應(yīng)。重復(fù)性好,PCV2定量PCR檢測的最大批次內(nèi)的變異系數(shù)為0.82%,批次

7、間為1.24%;PRRSV定量PCR檢測分別為1.27%和1.74%。
   通過對80份臨床樣品(40份來自正常豬,40份來自PMWS豬)的檢測,常規(guī)PCR方法檢測呈PCV2陽性的56份病料熒光定量PCR也為陽性,而常規(guī)PCR方法檢測PCV2為陰性的24份病料中熒光定量PCR檢測為陽性的有12份。對于臨床樣本的PRRSV檢測表明,比常規(guī)RT-PCR靈敏度高出10-100倍,檢測的10份樣品常規(guī)方法檢出5份陽性,熒光定量方法檢出

8、6份為陽性。說明與傳統(tǒng)PCR方法相比,熒光方法更加敏感。4皂苷類化合物對豬圓環(huán)病毒2型核酸疫苗的免疫佐劑作用
   為了探討免疫佐劑對PCV2核酸疫苗的免疫效果,我們以pcDNA3為基礎(chǔ),構(gòu)建了PCV2的ORF2(PcO)、ORF2-eGFP(POG)和不含核定位信號序列的AORF2(PcJ)的DNA疫苗,并聯(lián)合皂苷類佐劑TSA或TSB免疫小鼠2次,DNA疫苗和佐劑每次免疫的劑量分別為100μg和75μg,二免后14天采血用EL

9、ISA方法檢測特異性IgG及其亞類IgG1和IgG2b;取脾臟以熒光PCR定量檢測脾細胞IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10 mRNA表達。
   結(jié)果顯示,所有重組質(zhì)粒免疫小鼠的血清特異性IgG、IgG1和IgG2b水平均高于pcDNA3空載體(P<0.05或P<0.01),3種重組質(zhì)粒中,以PcJ誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體的作用最顯著,說明截短的ORF2的免疫效果優(yōu)于全長ORF2。重組質(zhì)粒與TSA或TSB佐劑組的特異性Ig

10、G及IgG1的水平均顯著高于單純重組質(zhì)粒免疫組(P<0.01):對3種重組質(zhì)粒免疫小鼠血清特異性抗體的佐劑作用TSA優(yōu)于TSB,TSA能顯著提高3種重組質(zhì)粒免疫小鼠血清中特異性IgG2b抗體水平(P<0.05或P<0.01),而TSB僅對PcJ質(zhì)粒免疫小鼠產(chǎn)生特異性IgG2b有促進作用(P<0.01),對PcO和POG質(zhì)粒免疫小鼠血清中特異性IgG2b抗體無顯著性影響(P>0.05)。除IL-4以外,重組質(zhì)粒免疫組脾細胞IL-2、IFN

11、-γ和IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于空質(zhì)粒對照組(P<0.05或P<0.01);而三種重組質(zhì)粒間對這些細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著差異。佐劑TSA和TSB均可顯著增強重組質(zhì)粒誘導(dǎo)的細胞因子轉(zhuǎn)錄(P<0.01),而且佐劑TSA的作用比TSB強(P<0.01,PcJ對IL-10的組合除外)。上述結(jié)果表明TSA和TSB不僅能顯著提高重組質(zhì)粒免疫小鼠血清中PCV2 ORF2特異性抗體水平,顯著促進脾淋巴細胞IL-4和IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄

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